Apelin-13通过激活ERK1/2通路复苏布比卡因诱导的心脏停搏

王石，何玉婷，陈郑洁，林婷婷，王权光，林丽娜

（温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015）

布比卡因作为局麻药的代表药物之一，因其起效较快、作用时间长、价格低廉等优点广泛应用于临床，但若用量过大或不慎入血，或机体高敏，都可能发生严重心脏毒性反应，致循环衰竭甚至心脏停搏[1]。APJ受体是细胞膜上的一种七次跨膜G蛋白偶联受体，广泛分布于全身多个重要脏器[2]。Apelin是APJ的特异性配体，作为一种多肽类物质，在反转录过程中可被蛋白水解酶分解为多个活性片段，其中Apelin-13是目前己知Apelin家族存在范围最广活性最强的片段。多年研究表明，Apelin/APJ系统有助于改善心室肥大、心力衰竭、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注、心律失常和冠心病等多种心血管系统的病理变化[3-5]。前期我们团队首次发现布比卡因能抑制乳鼠心肌细胞的Apelin-13及APJ蛋白表达，且呈布比卡因浓度依赖性。因此本研究拟建立在体布比卡因心脏骤停模型，给予外源性Apelin-13处理，观察其复苏结局，评价Apelin-13的解救作用并探讨其相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年SPF级雄性SD大鼠35只，体质量300～330 g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（浙）2015-0001。布比卡因（美国Sigma公司，货号B5274-5G），Apelin-13（美国Tocris Bioscience公司，货号217082-60-5），Apelin-13 ELISA试剂盒（上海博蕴生物公司），兔抗GAPDH单克隆抗体（美国CST公司，货号：#5174），兔抗APJ受体多克隆抗体（美国Abcam公司，货号ab214369），兔抗ERK1/2多克隆抗体（美国Abcam公司，货号ab115799），兔抗p-ERK1/2单克隆抗体（美国Abcam公司，货号ab223500），BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 构建大鼠心脏停搏模型：35 只大鼠随机分为3组：假手术组（Sham组，n=5），布比卡因+0.9%氯化钠溶液组（A组，n=15），布比卡因+Apelin-13组（B组，n=15）。参照文献[6]的方法构建大鼠心脏停搏模型。实验前禁食12 h，不禁饮。腹腔注射5%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，行气管切开连接呼吸机。呼吸参数设定：潮气量6 mL/kg，呼吸频率90～100次/min，吸呼比为2:3，FiO2100%。置入直肠温探头。开放右侧股动静脉置管，动脉连接生物信号采集系统，测定血流动力学指标。吸入0.5%～1.0%七氟醚维持麻醉，所有操作完成后，平衡 15 min（基础状态）时记录直肠温度、收缩压（systolic blood pressure，SBP）、心率（heart rate，HR）和收缩压与心率乘积（rate pressure product，RPP）。停止七氟醚吸入，经静脉20 s内注射 0.4%布比卡因30 mg·kg-1诱导心脏停搏，心脏停搏的判断标准为平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）≤10 mmHg。心脏停搏记为零点。Sham组在麻醉下行气管切开及股动静脉置管，不制备心脏停搏模型。

1.2.2 复苏方案：参照文献[7]的方法进行复苏。复苏过程由3位操作者参与，大鼠心脏停跳后立即由操作者1行人工胸外按压，直至自主循环恢复（return of spontaneous circulation，ROSC）或至40 min放弃。操作者2于零点时对B组大鼠给予150 μg Apelin-13，A组静脉注射等量0.9%氯化钠溶液。操作者3在复苏期维持气道通畅，并评估RPP指标。ROSC的判断标准是出现规律自主心律，RPP≥20%基础值并维持1 min以上。通过可调节保温毯及无影灯保持直肠温度37.5～38.5 ℃。复苏成功的大鼠观察至ROSC后120 min处死取心脏组织，放置液氮保存。

1.2.3 记录大鼠复苏结果：记录开始给布比卡因到心脏停搏时间（T0）、心肺复苏开始至出现第1个自主心跳的时间（Ts）和心肺复苏开始至ROSC出现的时间（Tr）。记录2组大鼠成功复苏例数、120 min 复苏期末生存例数。计算复苏率、生存率。复苏率=大鼠复苏成功例数/大鼠总数；生存率=存活至120 min复苏期末的大鼠例数/大鼠总数。

1.2.4 记录2组大鼠的血流动力学：记录2组大鼠ROSC后120 min内的SBP、HR、RPP，以及各时间点RPP与基础状态RPP的比值（RPPh）。

1.2.5 左心室组织中Apelin-13浓度测定：取20 mg 左心室组织匀浆离心取上清液，根据Apelin-13 ELISA试剂盒说明书采用双抗体夹心原理检测Apelin- 13浓度。

1.2.6 Western blot检测左心室组织APJ、ERK1/2、 p-ERK1/2蛋白的相对表达量：取30 mg左心室组织加入含1% PMSF的RIPA强效裂解液，匀浆提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度并配置上样蛋白。SDSPAGE电泳将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭1 h，之后用兔抗GAPDH（1:1 000）、兔抗APJ（1:500）、兔抗ERK1/2（1:1 000）、兔抗p-ERK1/2（1:1 000）等一抗4 ℃水平摇床孵育过夜，次日加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1:5 000）室温孵1 h后加入ECL发光液，用凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）自动显影读取条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0软件进行分析。计量资料用 ±s 表示，2组比较采用独立样本t 检验；多组比较采用单因素方差分析，方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett’s T3检验。重复测量资料比较采用重复测量方差分析，计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠基础值比较 3组大鼠体质量、肛温和血流动力学指标的基础值比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 2组大鼠复苏结果比较 与A组比较，B组复苏成功率和生存率升高、Tr缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）；2组T0与Ts差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 3组大鼠体质量、肛温和血流动力学指标基础值比较（ ±s）

表2 2组大鼠复苏情况各指标比较（n=15）

2.3 2 组ROSC后血流动力学比较 与A组比较，ROSC后20 min内B组HR明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与A组比较，ROSC后10～20 min内，B组RPP和RPPh明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；2组在ROSC后20 min内SBP差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.4 3组大鼠心肌组织蛋白表达量比较 与Sham组比较，A组心肌Apelin-13、APJ、p-ERK1/2蛋白表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与A组比较，B组心肌Apelin-13、APJ、p-ERK1/2蛋白表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；3组间ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3 讨论

布比卡因所致的心脏骤停一直是棘手且危急的临床情况，常规复苏非常困难，病死率高，近几年来越来越多的研究报道脂肪乳剂是解救布比卡因心脏毒性的特效药，但大剂量的输注脂肪乳剂带来的不良反应[8]使我们迫切地寻找其他更安全的药物来有效处理这一紧急情况。目前在解救布比卡因心脏毒性研究领域上，至今无其他团队报道Apelin-13在其中发挥的作用。本研究制备大鼠布比卡因心脏停搏模型，给予外源性Apelin-13 处理，结果表明Apelin-13可以加快达到ROSC时间，加快大鼠血流动力学恢复，提高复苏成功率和生存率，证实了Apelin-13可有效解救布比卡因心脏毒性。这提示Apelin-13有望成为解救布比卡因心脏毒性新的特效药，给临床提供了新的指导意义。

图1 2组大鼠ROSC后血流动力学情况

表3 3组大鼠心肌组织Apelin/APJ及ERK1/2通路蛋白表达量比较（n=5， ±s）

Apelin-13可启动Apelin/APJ系统，在中枢和外周发挥正性肌力[9]、调节血压[10]、促进血管生 成[11]等作用。而本研究结果显示，与Sham组比较，A组心肌组织的内源性Apelin-13及APJ蛋白的表达下降，验证了前期的心肌细胞实验，说明了布比卡因也许通过抑制Apelin/APJ系统的表达发挥心脏毒性。众所公认，细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）通路是经典的正性肌力通路[12]，作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族的一个重要成员，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其中特定苏氨酸残基和酪氨酸残基被磷酸化后则ERK1/2分子激活，从而发挥其生物学效应。越来越多的研究表明Apelin/APJ系统在心血管系统的 保护作用与激活ERK1/2蛋白磷酸化息息相关。YIN等[13]发现Apelin-13可通过激活ERK1/2信号通路促进H9C2心肌细胞增殖。ROSTAMZADEH等[14]报道Apelin可通过激活ERK1/2磷酸化发挥正性肌力及重塑心肌病理结构作用，有助于改善肾性高血压所致心力衰竭。PERJES等[15]报道Apelin可通过激活ERK1/2磷酸化从而产生正性肌力、正性传导和正性频率作用。本研究结果显示，与A组相比较，B组可上调大鼠心肌中Apelin-13、APJ及p-ERK1/2表达，但不影响ERK1/2表达，说明Apelin-13启动Apelin/APJ系统，激活ERK1/2磷酸化从而发挥其解救作用。

综上所述，Apelin-13 可解救布比卡因诱导的大鼠心脏停搏，其机制可能与激活ERK1/2通路蛋白磷酸化有关。