脑源性神经营养因子对人冠状动脉内皮细胞增殖和克隆的影响

孔继昌 王恩艳 张巍 戴坤鹏 刘少云 付永杰 郭志强

近年来，老年人群中CHD、脑血管意外等心脑血管疾病发病率越来越高，已经成为威胁人类健康最严重的疾病之一，其中动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）被认为是心脑血管疾病重要的病理基础和直接诱因［1］。AS 能够广泛侵袭全身血管，造成器官损伤，引起多种疾病的发生。血管内皮细胞作为机体重要的代谢和内分泌器官，其结构及细胞功能受损在心血管疾病的发生发展中起重要作用。多篇文献报道，脑源性生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）参与调节多种内皮细胞的生长及分化，作为一种新的促血管新生因子，其能够促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的血管新生［2］。最近有研究发现，在T2DM 合并颈动脉粥样硬化病人的血清中，BDNF水平降低，暗示血清低水平的BDNF 可能参与颈动脉粥样硬化的发生及发展［3］。因此，本研究以人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）为实验对象，探讨BDNF对HCAEC功能的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HCAEC 系购自中科院上海细胞库；重组人源BDNF 蛋白购自ProSpec 公司；RPMI-1640 培养液购自HYCLONE 公司；胎牛血清、双抗和0.25%胰酶消化液购自Gibco 公司；细胞计数试剂盒（cell counting Kit-8，CCK8）购自北京索莱宝公司；兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（Phospho-Akt，p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、磷酸化mTOR（Phospho-mTOR，p-mTOR）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（Phospho-ERK1/2，p-ERK1/2）、Wnt 蛋白家族1（Wnt family member 1，Wnt1）、跨膜受体卷曲蛋白1（Frizzled1）、胞浆调节散乱蛋白1（dishevelled segment polarity protein 1 pseudogene 1，Dsh）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗兔IgG 抗体均购自Abcam 公司；细胞培养耗材均购自美国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理：HCAEC 置于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（0.1 mg/mL）的RPMI-1640培养液中，于37℃的5%CO2培养箱中培养24 h。取生长状态良好，处于对数生长期的细胞进行实验。细胞分为2 组，实验组加BDNF（50 ng/μL），对照组不做其他处理。

1.2.2 CCK8增殖实验：2组细胞培养24 h后，消化细胞，制备细胞悬液并计数，取100μL细胞悬液，以每孔1×103个/mL 细胞的标准接种到96 孔板中，每隔24 h检测1 次细胞活力，共检测4 次，检测前每孔加10μL CCK8 试剂，37℃培养箱中孵育1 h，使用酶标仪用450 nm激发光检测OD值，绘制增殖曲线。

1.2.3 平板单克隆形成实验：2 组细胞培养24 h 后，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞10 min，用RPMI-1640培养液终止消化，制备细胞悬液，按照2×103个/mL 细胞数接种到100 mm 培养皿中，实验组加入含BDNF（50 ng/μL）的RPMI-1640 培养液，对照组加入等量的RPMI-1640培养液培养，3 d后更换培养液，再培养2 d，4%甲醛固定10 min，结晶紫染色20 min，显微镜下观察、拍照、计数。计数方法为：显微镜下任意选取5 个视野，统计单克隆数目，取5 个视野的平均数为最后结果。

1.2.4 免疫印迹（Western blot）实验检测信号通路相关蛋白表达水平：2 组细胞培养24 h 后，加RIPA 裂解液（使用前加入蛋白酶抑制剂）裂解提取蛋白，取适量蛋白液适度稀释，通过BCA 法测定浓度，剩余蛋白液加入LDS sample buffer 煮沸5 min。配制10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶，20μg/孔加入蛋白样品，转膜至硝化纤维素膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，快速冲洗掉一抗，TBST 缓冲液洗3 次，每次5 min，二抗室温孵育1 h，TBST 缓冲液洗3 次，每次5 min，加ECL 显色。实验独立重复3 次。采用Image J 分析所得图像，以目的蛋白/GAPDH灰度比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较均采用独立样本t检验或LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组HCAEC 增值能力比较 CCK8 实验结果显示，培养24 h 后，2 组细胞OD 值比较差异无统计学意义（P＞0.05）；培养48、72 h后，与对照组相比，实验组的细胞OD值均显著增加（P均＜0.05）。见表1。

表1 2组细胞增殖能力比较（±s，n=3）

表1 2组细胞增殖能力比较（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

72 h 0.8043±0.0573 1.1389±0.0747**组别对照组实验组0 h 0.2440±0.0415 0.2470±0.0101 24 h 0.3800±0.0330 0.4521±0.0441 48 h 0.5520±0.0671 0.7134±0.0638*

2.2 2组HCAEC 克隆形成能力比较 单克隆平板形成实验结果显示，培养5 d后，实验组的细胞克隆形成数目为（228±13）个，与对照组相比［（85±7）个］，差异有统计学意义（t=16.776，P＜0.05）。

2.3 2 组PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白表达水平比较 Western blot 结果表明，与对照组相比，实验组细胞中的PI3K/Akt/mTOR 信号通路关键组分Akt 和mTOR 蛋白表达水平差异无统计学意义（P均＞0.05），但p-Akt、p-mTOR 水平较对照组显著增加（P均＜0.05）见表2。

表2 PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达水平（±s，n=3）

表2 PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达水平（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

p-mTOR 0.413±0.069 0.584±0.059*组别对照组实验组Akt 0.767±0.082 0.704±0.043 p-Akt 0.469±0.046 0.903±0.075**mTOR 0.734±0.059 0.769±0.069

2.4 2 组ERK 信号通路蛋白表达水平比较 Western blot 结果表明，2 组细胞中的ERK 信号通路关键组分ERK1/2 蛋白表达水平差异无统计学意义［（0.609±0.032）比（0.587±0.044），t=0.7179，P=0.5125］；而实验组p-ERK1/2 表达水平较对照组显著升高［（0.377±0.022）比（0.547±0.051），t= 5.3766，P=0.0058］。

2.5 2 组Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达水平比较 Western blot 结果表明，与对照组相比，实验组Wnt/β-catenin 信 号 通 路 相 关 蛋 白Wnt1、Frizzled1 和Dsh的蛋白表达水平均显著增加（P＜0.01）。见表3。

表3 2组Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平比较（±s，n=3）

表3 2组Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平比较（±s，n=3）

注：与对照组比较，**P ＜0.01

Dsh 0.339±0.043 0.690±0.041**组别对照组BDNF组Wnt1 0.086±0.060 0.364±0.053**Frizzled1 0.701±0.029 1.125±0.081**

3 讨论

研究表明，BDNF在神经细胞的生长发育、分化和再生、损伤修复等过程中发挥关键作用［4-5］。Guan等［6］研究发现，BDNF 在脑出血后表达上调，能够促进神经再生和血管生成。目前，BDNF 已经表现出了对PD［7］、AD［8］等神经系统疾病的治疗潜力。另有研究表明，BDNF 在HUVECs 和人脑血管内皮细胞等多种内皮细胞以及新生血管平滑肌细胞中表达，参与维持血管内皮细胞的存活［9］，促进血管内皮细胞的增殖、迁移并抑制细胞衰老和凋亡，促进血管新生［10］。但目前尚无BDNF 对HCAEC 功能的影响及其作用机制的相关报道。本研究发现，外源添加BDNF 处理可明显促进HCAEC 的增殖和克隆能力，与在HUVECs 中发挥的功能类似。然而，BDNF 调节HCAEC 增殖和克隆能力的具体分子机制和所涉及的信号转导通路还尚未清楚。

PI3K/Akt/mTOR 信号通路是生物体内关键的信号通路，参与调控细胞增殖、存活和凋亡等生理活动［11］。在HUVECs 中，BDNF 就是通过PI3K/Akt 信号传导通路促进HUVECs 的体外迁移和存活［2］。本研究发现，BDNF 处理增加了Akt 和m-TOR 蛋白的磷酸化水平，促进了PI3K/Akt/mTOR 信号通路的活化，提示PI3K/Akt/mTOR 信号通路可能参与了BDNF诱导的HCAEC增殖和克隆。ERK1/2是一个能够介导血管新生的重要的信号蛋白，在HUVECs 中，ERK1/2 被BDNF 诱导磷酸化，参与了HUVECs 细胞增殖［2］。本研究发现，BDNF 处理同样增加了HCAEC 中ERK1/2蛋白的磷酸化水平，因此，ERK 信号通路也可能参与了BDNF促进HCAEC增殖的过程。

Wnt/β-catenin 信号通路也是一条生物发育、细胞增殖和凋亡等生理活动的关键信号通路。研究发现，Wnt/β-catenin 信号通路参与了BDNF 诱导神经元细胞及神经元干细胞生长的过程［12-13］。因此，本研究分析了HCAEC 中BDNF与Wnt/β-catenin信号通路的关系。结果表明，BDNF 处理组细胞中的Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白Wnt1、Frizzled1 和Dsh 的表达水平升高，提示Wnt/β-catenin 信号通路可能也参与了BNDF诱导的HCAEC 增殖和克隆过程。那PI3K/Akt/mTOR信号通路、ERK 信号通路和Wnt/β-catenin 信号通路具体是如何参与BDNF 对HCAEC 增殖和克隆的诱导过程的呢？这三条信号通路是否有相互联系？这将是我们下一步深入研究的重点。

综上所述，本研究发现BDNF 能够诱导HCAEC的增殖和克隆，可能通过调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路、ERK 信号通路和Wnt/β-catenin 信号通路发挥作用。本研究揭示了BDNF 在HCAEC 生长过程中具有重要意义，为将来BDNF在AS临床治疗中的应用提供了参考。