生防细菌ML-3抗菌蛋白稳定性研究

李静舒　赵佳

摘 要：为确定ML-3表达的抗菌蛋白在不同外部环境下的稳定性，本研究采用不同温度、pH、紫外光照時间、金属离子、蛋白酶处理，对ML-3抗菌蛋白抑菌性进行研究。结果表明：该抗菌蛋白在低于60℃、pH5～8、紫外光照24h下可以保持较高抑菌活性;对Cu2+和Mg2+敏感，对Na+、K+、Zn2+和Fe2+不敏感;对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，对蛋白酶K不敏感。提示ML-3抗菌蛋白在田间生物防治中具有一定应用潜力。

关键词：ML-3抗菌蛋白;温度;pH;紫外光照;金属离子;蛋白酶

中图分类号：S-3

文献标识码：A

细菌侵染类型的病害具有种类多、分布广、危害重的特点，严重制约了农业发展。马铃薯早疫病（Alternarin solani Sorauer）是制约马铃薯正常发育的真菌病害之一，其是由链格孢属的茄链格孢菌（Alternaria solani）引起，主要发生在植株的叶部和块茎，危害性仅次于晚疫病[1]。这种病害高发于马铃薯主要种植区，严重影响生产，降低马铃薯的产量和质量，还有可能导致大范围内病害流行。目前农业上主要采用化学农药来防治菌物病害[2]。但是，这种以化学性农药为主的密集型杀害方法，不仅会使病害对药剂产生抗药性，还会破坏农业生态系统，对人类健康造成影响[3]，采用生物防治的方法来减少化学农药的投入是发展的趋势。

山西省农科院生物技术中心曾从马铃薯茎部分离筛选出了1株马铃薯早疫病拮抗菌株ML-3。本研究旨在确定ML-3表达的抗菌蛋白在不同外部环境下的稳定性，评价该抗菌蛋白在田间的适用可能性，进而为开发抗马铃薯早疫病的生物农药提供思路，为生物防治作物病害方面的应用奠定一定基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验菌株及培养基

1.1.1 实验菌株

ML-3拮抗菌株和马铃薯早疫病病原菌，由山西农业科学研究院保存和提供。

1.1.2 供试细菌培养基质

参照高振峰[4]的方法配制培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株ML-3的活化

菌株ML-3（-80℃冰箱冻存）解冻后，取50μL悬浮液，用接种环接种到新鲜配制的NA平板上，于30℃下恒温培养48h。

1.2.2 马铃薯早疫病病原菌活化

用接种环少量挑取马铃薯早疫病病原菌，接种到新配制的PDA平板上，于30℃下温箱恒温培养3d;待菌落直径长到约1.5cm左右时，挑取菌丝转接到新配制PDA平板上，于30℃下温箱恒温培养7d，为后续实验准备。

1.2.3 菌株ML-3的发酵液制备

将活化培养48h后的菌株ML-3置于超净台内，用接种环挑取一环，接种到装有100mL新配制NB培养液的三角瓶中，于30℃下、振速180r/min培养72h后，终止发酵，得到菌株ML-3的种子发酵液。取发酵液接种到新配制NB培养液中，接种比例为1%（V/V）。于30℃下、振速180r/min培养72h后，终止发酵。于4℃下、转速10000r/min离心10min，最后将上清液通过微孔滤膜进行除菌，用于蛋白提取。

1.2.4 菌株ML-3抗菌蛋白的硫酸铵盐析提取

根据吴艳[5]的方法提取抗菌蛋白，量取1000mL菌株ML-3发酵液到量杯中，冷水浴中加入饱和度为80%的硫酸铵，并保持搅拌，待固体溶解后，放置于4℃冰箱中进行沉淀。12h后，于转速10000r/min下离心10min，倒掉上清液。向沉淀物中加入10mL的Tris-HCL（0.01mol/L，pH8.4）缓冲液充分溶解。溶解后将溶解物装入透析袋中，在Tris-HCL（0.01mol/L，pH8.4）缓冲液中透析，每过4h更换1次缓冲液，透析72h。透析完成后，于真空冷冻干燥机中制成冻干蛋白粉，保存于-20℃冰箱备用。

1.2.5 ML-3抗菌蛋白抑菌活性检测

根据采俊香、李月梅[6]的菌丝生长速率法测定抑菌率。配制浓度为0.1g/L的ML-3抗菌蛋白液，按照1∶9的比例（V∶V）将蛋白液和液体PDA培养基混合，注意不要产生气泡，倒入灭菌培养皿中，制备含药平板，等待凝固。在活化后的马铃薯早疫病原真菌平板上用灭菌打孔器取直径为5mm的菌饼，接种到凝固后的含药平板中心位置，将Tris-HCl（0.01mol/L，pH8.4）设置为对照物，于30℃下恒温培养3d，重复实验3次。

抑菌率计算公式：

抑菌率（%）=D2-D3D1-D3×100%

式中，D1为对照物处理病原菌菌落直径（mm），D2为抗菌蛋白处理病原菌菌落直径（mm），D3为菌饼直径（mm）。

1.2.6 ML-3抗菌蛋白稳定性分析

1.2.6.1 温度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

取8支10mL的灭菌离心管，分别加入5mL抗菌蛋白液，按照温度梯度为22℃（室温）、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃在水浴锅中处理20min，冷却至室温，进行抑菌活性测定，方法同1.2.5，重复实验3次。

1.2.6.2 酸碱度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

取8支10mL的灭菌离心管，分别加入5mL抗菌蛋白液，用HCl和NaOH（C均为1mol/L）分别调整pH至4.0，5.0，6.0，7.0（原始），8.0，9.0，10.0，11.0，室温静置30min，全部调回原始pH，以未经处理的抗菌蛋白液为对照，进行抑菌活性测定，方法同1.2.5，重复实验3次。

1.2.6.3 紫外光照对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响