明党参内生菌对苯磺隆的生物降解作用

叶晓婉 张桂丽 戚贺飞

关键词：明党参;内生菌;苯磺隆;降解率;生物学鉴定

明党参（Changium smyrnioides Wolff）为我国特有的伞形科明党参属植物，别称山花、山萝卜、明参、明党[1]。明党参是草本植物，周围易杂草丛生，杂草与明党参植株竞争土壤中的营养成分，从而影响植株的生长发育，而磺酰脲类除草剂，如苯磺隆，能够有效去除其周围杂草，使明党参旺盛生长。

苯磺隆（tribenuron-methyl，TBM），别称麦乐乐、苯磺隆、巨星（杜邦）、亿力、阔叶净、麦磺隆等，是20世纪80年代由美国杜邦公司开发的一种内吸传导型磺酰脲类麦田除草剂[2-5]，主要用于防除各种一年生阔叶杂草。苯磺隆在我国长江、黄河和淮河流域有着广泛的使用范围。苯磺隆的大量使用，给土壤、水体、生物及大气等诸多环境因子造成大量污染，影响农业生产和生态平衡[6-8]。因此，解决苯磺隆的残留问题对改善除草剂对作物的药害，修复受除草剂污染的土地有重要的理论意义和实际价值。而在生态系统中，作为分解者的微生物，代谢类型多样，适应环境的能力极强，能利用各种人工合成的农药作为碳、氮源生长，并将其完全降解成无机物[9]。田爽等筛选出4株能以苯磺隆为唯一碳源生长的降解菌，并对其生理生化特性进行研究[9]。Zhang等筛选出一株苯磺隆降解菌，经初步鉴定为假单胞杆菌，根据所查资料，国外尚未见有关于降解苯磺隆菌株的研究报道[10]。本试验从明党参内生菌着手，进行一系列的研究，旨在从中筛选出能够高效降解苯磺隆的明党参内生菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 无机盐培养基（inorganic salt medium，IS）：磷酸二氢钾（3.0 g/L）、七水硫酸镁（0.1 g/L）、硝酸铵（2.0 g/L）、磷酸氢二钾（1.5 g/L）、无水氯化钙（0.01 g/L）、乙二胺四乙酸二钠（0.01 g/L），pH值7.5±0.1，25 ℃。营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）：牛肉浸粉（3.0 g/L）、蛋白胨（10.0 g/L）、氯化钠（5.0 g/L）、琼脂粉（15.0 g/L），pH值7.3±0.1，25 ℃。

1.1.2 试验样品与试剂 试验样品明党参产自河南省郑州市某中草药试验田。试验试剂：苯磺隆（纯度95%）由中国沈阳化工研究所提供;甲醇（色谱纯）由天津市科密欧化学试剂有限公司生产;乙腈（色谱纯）由天津市科密欧化学试剂有限公司生产。

1.1.3 试验仪器和设备 一次性无菌进样器（1 mL）：江苏华达医疗器材有限公司生产;紫外可见分光光度计（UV2600）：日本岛津仪器有限公司生产;高效液相色谱仪（Agilent 1200）：安捷伦科技有限公司生产;台式高速冷冻离心机（Allegra 64R）：美国贝克曼库尔特有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 明党参内生菌的分离 取明党参的根、茎、叶等组织部位，将组织表面的泥土等杂质用自来水冲洗之后在干净的自来水中浸泡1 h;然后移入无菌超净工作台，用无菌水再次冲洗3次之后用无菌滤纸吸干表面的水分。采用“75%乙醇-2.5%次氯酸钠-75%乙醇”三步表面消毒法将各组织消毒，其中根组织用75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸钠浸泡7 min，75%乙醇浸泡20 min;茎组织用75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸钠浸泡5 min，75%乙醇浸泡18 min;叶组织用75%乙醇浸泡 2 min，2.5%次氯酸钠浸泡3 min，75%乙醇浸泡 15 min。表面消毒过的明党参组织，分别用无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干表面的水分。之后用灭菌的镊子、剪刀、无菌刀片将明党参的根与叶组织剪切成0.5 cm×0.5 cm的小块，茎组织剪切成长度约为0.5 cm的组织。在NA、PDA、高氏一号培養基的平板上，分别等距接种4个根、茎、叶组织块，每个处理重复3次。将平板依次放置到37、28、30 ℃培养箱中，观察平板中组织边缘菌落生长状况。

对照组：采用组织印迹法，将以上经过消毒处理的根、茎、叶组织放入NA、PDA、高氏一号培养基中，使灭菌材料表面与培养基接触20 min后移走明党参各组织块，并将培养基置于相同条件下培养相同时间，观察平板是否有肉眼可见的菌落长出。

1.2.2 明党参内生细菌的纯化与保藏 待平板中组织块边缘长出可以用肉眼观察到的菌落后，用接种环挑取少许边缘菌落接种到新的NA培养基中，37 ℃恒温箱中倒置培养，待菌落生长后重复此操作6次以上进行纯化，直到得到单一的纯菌落。定期观察，挑选优势单菌落划线纯化后甘油保藏备用。

1.2.3 苯磺隆降解菌的筛选 （1）初筛。将以上分离得到的明党参内生菌接种在NA培养基上进行活化，再转接到营养肉汤培养基中，37 ℃、150 r/min下培养12 h。配制无机盐固体培养基，121 ℃、0.1 MPa 下灭菌15 min。在超净工作台中，向无机盐培养基中加入等量的浓度为10%的苯磺隆溶液，倒平板，冷却。分别取1 mL菌液接种于无机盐培养基，无菌环境下涂布，37 ℃恒温培养箱进行培养。将得到的菌株接入NB培养基，37 ℃、150 r/min振荡培养1 d，向100 mL无机盐液体培养基中加入浓度为10%的苯磺隆溶液1 mL，取1 mL NB培养基中的菌液接种于无机盐液体培养基，37 ℃、150 r/min振荡培养，定时取样，于D600 nm测定菌株的生长情况，重复多次。（2）复筛。配制150 mL的无机盐液体培养基，121 ℃、0.1 MPa下灭菌15 min。在超净工作台中，向培养基加入苯磺隆标准品0.45 g，摇匀混合。将初筛得到的菌液接种于此，37 ℃、150 r/min 振荡培养，定时观察无机盐培养基的清晰程度，并定时取样，于D600 nm测定菌株的生长情况，重复多次。

2.4.2 降解菌的16S rDNA基因序列同源性分析 经过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、纯化回收DNA目的条带、PCR引物测序，菌株PMG3的16S rDNA基因序列全长为1 418 bp。选取与内生菌菌株同源性较高的10株菌株的16S rDNA基因序列构建系统发育进化树，结果见图4。通过BLAST同源性比对，结果表明，菌株PMG3与Bacterium wsb-1和Bacillus tequilensis stain Y11进化距离较近;结合菌株形态特征、生化特性、微生物质谱鉴定结果和16S rDNA基因序列同源性分析，初步鉴定菌株PMG3为芽孢杆菌属（Bacillus sp. PMG3）。

2.4.3 降解菌的质谱分析 本试验所用的质谱仪基本原理是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术[11]，根据离子的质荷比与离子的飞行时间成正比，检测样品到达检测器的飞行时间即可检测离子，对样品进行分析，通过与数据库信息比对，筛选并确定相应图谱，进而得到鉴定结果，从而实现对不同细菌属、种的鉴定。菌株PMG3的质谱图谱如图5所示，菌株PMG3在4 307.89 m/z附近离子流强度最大， 其峰高为1 600， 峰面积为2 789 635，信噪比为28，分辨率为753。菌株PMG3经检索后与数据库中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的匹配分值为9.115，菌株PMG3鉴定为芽孢杆菌属。

3 讨论与结论

苯磺隆是一种乙酰羟基酸合成酶（AHAs）抑制除草剂[12]。AHAs又称乙酰乳酸合酶，催化支链氨基酸合成途径的第一步，包括缬草碱、亮氨酸和异亮氨酸[13-14]。苯磺隆通过将AHAs活性位点转变为难以与底物结合的构象来抑制杂草。目前，国内外关于苯磺隆的研究主要集中在药理、残留分析方法及其对植物生理特性的影响等方面[6-7，15-23]。虽然在苯磺隆的筛选、鉴定等方面已有一些文献报道，如田爽等筛选出4株能降解苯磺隆的菌株[9]。Zhang等筛选出2株苯磺隆降解菌，但很少涉及苯磺隆降解试验及降解率指标，所报道降解菌的降解效率不明晰，且菌源多为土壤[10]。杜迅等的试验菌源来自河南省临颍县麦田[24]，田爽等的试验菌源来自受农药苯磺隆污染的土壤[9]。

本研究首次以中草药明党参为菌源材料，分离得到了1株能够高效降解苯磺隆（降解率接近 89.07%）的内生菌，并对能高效降解苯磺隆的明党参内生细菌进行生物学鉴定，根据16S rDNA基因序列同源性分析以及质谱结果确定属于芽孢杆菌属，这与已有文献多数报道的降解菌不同，丰富了苯磺隆降解菌资源库，对于修复受苯磺隆污染的农田有着重要意义，也为中草药内生菌资源利用及农药生物降解菌的筛选开辟了新途径。

苯磺隆作为磺酰脲类除草剂的一员，沸点较低，并且国内外对其报道都相对较少，再加上试验条件和试验时间所迫，本研究还存在一定的不足。今后可以在苯磺隆的降解条件、降解机理等方面進行探讨和研究，为中草药内生菌降解苯磺隆提供理论依据。

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