益肾调气法对血管性痴呆模型大鼠脑单胺神经递质的干预作用

王丹 赵瑞珍 李小黎

摘要 目的：通過探讨血管性痴呆（VD）大鼠脑内单胺神经递质变化，研究益肾调气法对VD大鼠的干预机制。方法：选购雄性Wistar大鼠，通过旷场试验分为正常组、卒中组。MCAO法制备缺血性脑卒中模型，常规饲养28 d后经水迷宫试验筛选VD大鼠，并随机分为观察组和模型组。正常组和模型组灌胃蒸馏水，观察组灌胃颐脑解郁方，干预4周。灌胃第1、2、4周对各组大鼠行水迷宫检测;第4周灌胃后取材，采用高效液相检测大鼠右侧海马、前额叶皮质5-HT、NE、DA含量。结果：与正常组比较，模型组大鼠1、2、4周跳台潜伏期缩短、错误次数增加、水迷宫潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，观察组第2、4周水迷宫潜伏期缩短，差异有统计学意义（P<0.01），第4周跳台潜伏期延长、错误次数减少，差异有统计学意义（P<0.01）。模型组皮质及海马NE、DA、5-HT含量较正常组降低，差异有统计学意义（P<0.01），观察组海马DA含量较模型组升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：益肾调气法可改善VD大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与调节大鼠脑内NE、DA及5-HT含量相关。

关键词 血管性痴呆;颐脑解郁方;去甲肾上腺素;多巴胺;5-羟色胺;益肾调气法;动物实验

Abstract Objective：To study the intervention mechanism of tonifying kidney and regulating qi method on vascular dementia（VD）rats by investigating the changes of monoamine neurotransmitters in the brain of VD rats.Methods：Male Wistar rats were selected and divided into a normal group and a stroke group by open field test.MCAO method was used to prepare ischemic stroke model.After 28 d of routine feeding，VD rats were screened by water maze test and randomly divided into a treatment group and a model group.The normal group and the model group were infused with distilled water，and the treatment group was infused with Yinao Jieyu Formula for 4 weeks.At the 1st，2nd and 4th weeks of gavage，the rats in each group were tested for water maze，and at the 4th week after gavage，the material was taken and the contents of 5-HT，NE，DA in the right hippocampus and prefrontal cortex of rats was detected by high-performance liquid.Results：Compared with the normal group，the latent period of 1，2 and 4 weeks of platform jumping were shortened，the number of errors increased，and the latent period of water maze was significantly prolonged（P<0.01）.Compared with the model group，the latent period of water maze at 2 and 4 weeks of treatment group was shortened（P<0.01），and the latent period of platform jumping at 4 weeks was prolonged and the number of errors decreased（P<0.01）.The content of NE，DA，5-HT in the cortex and hippocampus of the model group was lower than that in the normal group（P<0.01），and the hippocampal DA content in the treatment group was higher than that in the model group（P<0.01）.Conclusion：The tonifying kidney and regulating qi treatment can improve the learning and memory ability of VD rats，and its mechanism may be related to the content of NE，DA and 5-HT in the rat brain.

Keywords Vascular dementia; Yinao Jieyu Formula; Norepinephrine; Dopamine; 5-hydroxytryptamine;Tonifying kidney and regulating qi method; Animal experiments

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是脑卒中后常见并发症之一，该病发生率高，临床表现为记忆、认知功能障碍，属于严重认知障碍的脑血管疾病[1]。中医归属“多忘”“痴呆”“呆病”等范畴，目前对于卒中后向VD转变的机制尚未有明确结论。近年来，国内外学者从神经递质对VD的发病机制进行了深入探讨，其含量的变化与学习记忆关系密切[2-3]，本研究在前期研究的基础上通过观察血管性痴呆大鼠模型中药干预前后的行为学及前额叶皮质、海马不同脑区单胺类神经递质浓度3个方面的变化情况，探讨颐脑解郁方对脑缺血后VD大鼠的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠（200±10）g，SPF级，6周龄，动物许可证：SCXK（京）2016-0006，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠适应性预养1周，自由摄食和饮水，动物房室温（23±1）℃（冷、热应激除外），相对湿度50%～60%，光照周期昼夜各12 h（6：00～18：00光照;18：00～6：00黑暗）。

1.1.2 药物 颐脑解郁方颗粒（由郁金、刺五加等药物组成，由北京康仁堂药业有限公司提供，北京中医药大学第三附属医院制成颗粒）。配比成419 mg/kg混悬液（即1剂配方颗粒加100 mL蒸馏水）相当于成人剂量的7倍计算，存贮在4 ℃的冰箱中备用，再临用前加热。

1.1.3 试剂与仪器 尼龙栓线（北京沙东生物技术有限公司，货号：2838-A4）、戊巴比妥钠（美国Sigma公司，货号P3761-5），去甲肾上腺素试剂（美国Sigma公司，货号：A9512）、多巴胺试剂（美国Sigma公司，货号：H8502）、5-羟色胺试剂（美国Sigma公司，货号：H7752）。电子天平（珠恒电子有限公司监制，型号：JCS-11002A）、Morris水迷宫（北京中医药大学中医学院，型号：KW-MWM）大鼠跳台仪（中国中医科学院，型号：DZY-DG-8S）、高效液相色谱仪（美国ESA公司，型号：Model 5600A）、8通道库仑电化学检测器（美国ESA公司，型号：Model 5300A），美国EAS公司软件（美国ESA公司，型号：Version3.1）、超速低温离心机（美国Sigma公司，型号：2K15）、超声波发生器（美国Sigma公司，型号：MJ-300）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备

1.2.1.1 分组 购入雄性Wistar大鼠65只，饲养1周，采用Open-filed评分随机分为正常组10只、脑卒中模型组55只。用MCAO法制备缺血性脑卒中模型，MCAO术中死亡9只，术后1周死亡7只，28 d后经Morris水迷宫筛选出20只VD大鼠进入实验，随机分为模型组、观察组，正常组10只，模型组10只，观察组10只。

1.2.1.2 模型制备 1）缺血性脑卒中（Ischemic Stroke，IS）大鼠模型制备：制备IS模型[4]，大鼠称重后，用1%戊巴比妥钠溶液5 mL/kg腹腔注射麻醉。沿颈正中线开口约1.5 cm，钝性分离两侧肌肉及腺体，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，在颈总动脉近心端开一小口，插入尼龙栓线至颈内动脉，当栓线插入距颈总动脉分叉1.8～2.0 cm处并有轻微阻力时即可。造模成功后的大鼠待2 h后将栓线轻轻抽出0.5～1.0 cm，使血液再灌注。2）参考Longa 5分制法，其中0分表示无神经损伤症状;1分表示不能完全伸展对侧前爪;2分表现为向对侧转圈;3分表现为向对侧倾倒;4分表现为不能自发行走，意识丧失，分值越高，说明大鼠行为障碍越严重。对术后2 h再灌注后大鼠，待其麻醉清醒后进行评分，将评分小于等于1分及大于等于4分大鼠剔除，不予纳入。大鼠于缺血再灌注2 h后出現行走转圈、对侧前肢蜷曲或走向对侧倾倒的体征者可纳入，无此体征或者2 h后仍不清醒者，弃去。3）制备建立MCAO模型后，对大鼠进行常规饲养，于28 d后行水迷宫评价[5-6]，（实验组大鼠平均逃避潜伏期-正常组组大鼠平均逃避潜伏期）/实验组大鼠平均逃避潜伏期>20%定为VD鼠进入实验。

1.2.2 给药方法 VD模型组灌胃蒸馏水，观察组灌胃中药颐脑解郁方，灌胃剂量10 mL/kg，1次/d，持续4周。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 宏观表征像观察 于每周灌胃前1 d观察各组大鼠的表征像，包括观察各组大鼠的行为活动（如活动度、攻击行为、探索行为、修饰行为等）、精神状态、以及毛发色泽、粪便质地以及舌质舌色等一般情况的变化。

1.2.3.2 行为学测试 1）Morris水迷宫实验[7]（Water Maze Test，WMT）在安静、恒温的暗室进行，室温（23±1）℃、水温（22±1）℃。水迷宫的直径1.8 m，水深情况31 cm，水迷宫分为4个象限，平台放置于任1象限内1/3处，平台低于水面1 cm，位置保持不变。实验分5 d进行，前4 d训练1次/d，第5天测试。前4 d为定位航行实验，为：每只大鼠实验4次/d，每次从4个象限随机选取1个，并将大鼠放置水中，每只动物1个象限只能使用1次;单次游泳时限60 s;记录大鼠寻找、爬到平台所用时间，为逃避潜伏期。再让动物在平台上停留30 s后，进行下次的方向训练;如果60 s内没有找到水面下隐藏在的站台，则实验者再将大鼠引至平台地方;平台上个再停留30 s后，进行下一方向训练。当实验进行到第5天，撤平台后进行空间探索试验（Spatial probe），于定位航行实验后24 h后，撤除站台，从对侧象限放入大鼠，使其游泳60 s，记录逃避潜伏期及穿越平台位置次数。2）跳台实验跳台装置为15 cm×30 cm×30 cm的被动条件反应箱，将直径和高度都为4.5 cm大小的橡皮垫置于箱内底部一角作为被动回避电击反应的安全区。实验时先将大鼠放入箱中训练3 min，接通36 V交流电，记大鼠5 min内被电击的错误次数，为大鼠学习测试的成绩。24 h后进行记忆测试，测试时直接将大鼠放置于安全平台上，立即通电并记录每只大鼠第1次错误次数和跳下安全区的时间潜伏期），作为记忆测试成绩。入组大鼠在造模结束后分别于1、2、4周进行行为学测试，包括跳台实验、Morris水迷宫测试。

1.2.3.3 大鼠右侧前皮质及海马NE、DA、5-HT含量测定 完成行为学测试后，将大鼠断头而处死，在冰上迅速剥离出右侧前额叶皮质、海马，微量秤称重，将组织质量控制在20～50 mg，加入0.4 mL预冷的工作内标液，于冰浴下快速匀浆，静置10 min，4 ℃条件下14 000 g离心15 min，取上清液，用0.20 μm滤膜过滤，取100 μL上样测定或-80 ℃保存检测NE、DA、5-HT的含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示;不符合正态分布，用四分位数描述。符合正态分布且方差齐时，在多组间采用单因素方差分析比较，同组间比较则选取LSD检验;方差不齐时采用Weltch检验。数据不符合正态分布，采用非参数分析;重复测量数据，符合球形检验，采用重复测量方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组宏观表征像观察 VD组大鼠造模结束后，在灌胃1、2、4周节点观察发现，VD模型大鼠无明显变化，大部分静默少动，进食饮水较多、梳理行为较少，粪便稀溏。与之比较，灌胃4周后VD观察组自发活动、梳理行为增多、体质量稍减轻，粪便成形。

2.2 各组VD大鼠行为学变化

2.2.1 各组VD大鼠不同时间点跳台实验结果比较 灌胃1、2、4周后与正常组比较，VD模型组及VD观察组潜伏期均显著低于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）;于灌胃4周时与VD模型组比较，VD观察组潜伏期时间显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;灌胃1、2、4周时与正常组比较，VD模型组错误次数增加，差异有统计学意义（P<0.01）;治疗后VD观察组与VD模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2.2 各组VD组大鼠不同时间点Morris水迷宫实验结果比较 灌胃1周后与正常组比较，模型组大鼠逃避潜伏期的时间延长，差异有统计学意义（P<0.05）;与VD模型组比较，VD观察组逃避潜伏期时间没有延长，差异无统计学意义（P>0.05）;灌胃2周后与正常组比较，模型组逃避潜伏期时间明显延长，2组比较差异有统计学意义（P<0.01），与模型组比较，观察组逃避潜伏期缩短，差异有统计学意义（P<0.05）;灌胃4周后与正常组比较，模型组的逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，观察组逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

2.2.3 各组右侧前额叶皮质单胺类神经递质含量变化比较 与正常组比较，VD模型组NE、DA、5-HT含量均显著性降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与VD模型组比较，VD观察组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.2.4 各组右侧海马NE、DA、5-HT含量变化比较  与正常组比较，VD模型组NE、DA、5-HT含量均显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，VD观察组DA含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。VD观察组的NE、5-HT呈升高趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨论

血管性痴呆（VD）是脑血管病变导致颅脑局灶性神经功能损害引起的以认知功能障碍为特征的一组临床综合征[8]。归于中医学的“痴呆”“呆病”“多忘”等范畴。中医上，脑卒中后，肾精亏虚，不足以充盛脑髓，髓海亏虚元神失养[9]，则反应迟钝、出现神情淡漠、思维缓慢、记忆力减退等症状;肝肾同源，因肾精不足可致肝血亏虚;肝失疏泄，气机不畅，故可见情绪低落、胸闷不舒等症状，随着病程迁延，因虚致实，痰瘀互结，肾虚基础上，上蒙清窍，使病情更加缠绵难愈。导师通过总结多年来的临床经验，提出血管性痴呆在发生发展过程中，肾虚是其发病的基础，气机失调则为发病之诱因[10]为卒中后精神疾患的基本病机。治疗以益肾调气法谴方而成之颐脑解郁方是导师唐启盛教授临床多年经验的总结，临床取得了较好的疗效，但其作用靶点尚不清楚。

本次研究中就VD组大鼠而言，与正常组比较，VD模型大鼠整体表现为精神疲惫、喜倦卧懒动、眼神无光，对外界刺激反应低下，便质稀溏，口鼻色稍暗，舌润泽，舌色淡红，在1、2、4周节点上，VD模型组大鼠跳台实验潜伏期时间较正常组均明显缩短，错误次数明显增加，而水迷宫逃避潜伏期时间明显延长，较好地模拟了血管性痴呆患者认知功能及学习、记忆能力下降等核心临床表现，经中药颐脑解郁方治疗4周后，观察组大鼠跳台潜伏期时间延长，2、4周时水迷宫逃避潜伏期时间缩短，提示中药颐脑解郁方可以有效改善大鼠学习及记忆能力。脑血管病变后随着病程的延长，痴呆大鼠的逃避潜伏期时间（空间学习）及穿越平台次数（记忆能力）也逐渐下降。与临床血管性痴呆患者不同阶段出现的反应迟钝、思维混乱、记忆模糊、智力障碍等症状表现类似。因此结合多次行为学研究可以更好地探索出卒中后精神疾患模型大鼠的精神状况，而不同时间点行为学结果均均证实中药颐脑解郁方能在血管性痴呆不同阶段对大鼠表征像、行为学进行有效调节，这为我们进一步探讨颐脑解郁方对这一疾患发生发展过程中单胺类神经递质的干预作用奠定了良好的基础。

神经递质作为连接脑内神经元化学突触之间的信使，主要充当信息传递功能。其作用机制为通过与其突触后受体结合而产生神经生物学效应。本研究主要的单胺神经递质NE、DA、5-HT有广泛的活性，其神经纤维上行，可投射至额叶、海马，在中枢神经系统中起着重要的调节作用，共同协调的前额叶皮质是Papez环路的起始部位，海马是Papez环路的重要组成部分，与学习、记忆方面等功能相关[11-13]，额叶被认为在认知功能、行为和决策能力起重要作用。本次研究的IS大鼠模型均為右侧脑组织缺血坏死，右侧海马明显灌注不足，与左侧比较，引起更为显著的变化[14]，故取大鼠右侧海马、前额叶皮质作为观察标本。

NE神经元参与中枢系统的记忆学习，经调节突触而出现减少干扰刺激的传入，能更好地记录及保存有效信息[15];DA在调节额叶记忆功能方面起着主要作用[16];5-HT调节大脑的智能方面发挥着极其重要的作用[17]。本研究结果表明，NE、DA、5-HT均有不同程度地降低，提示当大脑缺血缺氧时，脑组织中的递质含量减少，从而引起记忆功能的改变[18]。本次研究观察组VD大鼠海马区相关神经递质含量较模型组增加，提示大脑海马区域神经递质的减少与VD的发病可能相关。

本研究结果显示，NE、DA、5-HT作为最主要的单胺类神经递质不仅参与了大脑行为的调控，还与情感障碍、学习和认知障碍相关。颐脑解郁方可以改善血管性痴呆大鼠的学习及记忆力下降，其作用机制可能改善大鼠脑内单胺类神经递质DA的含量有关。由此可见，本研究初步验证了单胺类神经递质能是颐脑解郁方发挥作用的一个靶点，但具体机制仍需进一步的探讨和研究。

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