响应面优化提取灰绿碱蓬多糖及脱色工艺研究

付建鑫，邵家威，方奕珊，张桂香*

(1.济南大学 食品科学与营养系，济南 250002；2.齐鲁工业大学 食品科学与工程学院，济南 250353)

灰绿碱蓬(SuaedaglaucaBunge.)，又名黄须菜，是一年生藜科碱蓬属草本盐生植物，多生长于滩涂及荒漠处，是盐碱地的特征植物。近些年来，岸基湿地、滩涂等土壤盐渍化现象日益严重，耕地土壤土质硬化，耕地资源紧缺，迫使人们不得不考虑开发利用盐生植物资源，所以研究及推广盐生植物的种植势在必行。碱蓬在我国不仅分布广泛，而且产量高。据统计，每年仅黄河三角洲地区的碱蓬产量就高达3.3×105t[1]。植物多糖除具有一般膳食纤维的特性外，还具有乳化及乳化稳定性、酸性条件下对蛋白颗粒的稳定作用、抗黏结性、成膜性及泡沫稳定性等特性，在食品工业有较多的应用。作为乳化剂已经广泛地应用在了咖啡奶油、乳化型调味料、咖啡伴侣以及牛奶蛋黄奶油中；作稳定剂的乳饮料类则口感更为清爽。除此之外，在人造奶油、色拉调味油、奶油调味汁等食品中，它可部分代替脂肪，保持水分，增加产品的稠感和黏附感[2]。

目前国内外主要着眼于盐地碱蓬、硬翅碱蓬耐盐机理研究及活性物质提取等方面，对灰绿碱蓬的多糖研究暂未报道。本研究以灰绿碱蓬为研究对象，测定了根、茎、叶及全株的基本营养成分，利用响应面法优化提取了碱蓬多糖并对其脱色方式进行了探究。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

灰绿碱蓬：采自山东东营；皂土、十六烷基三甲基溴化铵、HZ-800大孔树脂：国药集团化学试剂有限公司；石油醚、无水乙醇、硫酸铜、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、葡萄糖等试剂：均为分析纯。

702A紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；PHS-3B pH酸度计 赛多利斯科学仪器有限公司；FA2004N 电子天平 上海上平仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 灰绿碱蓬基本成分测定

1.2.1.1 蛋白质含量测定

按GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》执行。

1.2.1.2 总糖含量测定

按GB/T 15672—2009《食品安全国家标准 食用菌中总糖含量的测定》执行。

1.2.1.3 脂肪含量测定

按GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》执行。

1.2.1.4 黄酮含量测定

按GB/T 20574—2006《蜂胶中总黄酮含量的测定方法 分光光度比色法》执行。

1.2.1.5 皂苷含量测定

按GB/T 22464—2008《大豆皂苷》执行。

1.2.2 灰绿碱蓬多糖提取工艺

通过溶剂浸提法去除植株中少量脂肪及大量可溶性色素[3]。过量正己烷回流脱脂4～6 h，将脱脂后的索式提取系统用少量水冲洗，以75%乙醇为溶剂进行色素冲洗，直至提取管内无颜色变化为止。称量单位质量的已处理碱蓬干粉(200目)于烧杯中，加入一定量的沸水，封膜密闭后于超声清洗器中浸提。将冷却沉降后的提取上清液在8000 r/min 条件下离心10 min并旋转蒸发浓缩。无水乙醇按照4∶1的比例缓慢倒入浓缩提取液中并搅拌均匀，放置于4 ℃条件下冷藏，每隔3 h搅拌1次，沉淀过夜后，倾倒上层清液。下层溶液在7000 r/min 离心12 min 后，将沉淀用无水乙醇和石油醚洗涤多次后冷冻干燥，即为碱蓬粗多糖，多糖得率计算公式如下：

(1)

1.2.3 灰绿碱蓬多糖提取响应面设计

1.2.3.1 灰绿碱蓬多糖提取单因素试验

在单因素试验中，主要考察了提取温度、提取时间、超声功率、乙醇体积分数4个因素。其中，控制提取时间为50 min，超声功率为320 W，乙醇体积分数为65%，提取温度设定为50，65，75，85 ℃；控制提取温度为75 ℃，超声功率为320 W，乙醇体积分数为65%，提取时间选择30，40，50，60，70 min；控制提取温度为75 ℃，提取时间为50 min，乙醇体积分数为65%，选择超声功率为100，200，320，440 W；控制提取温度为75 ℃，提取时间为50 min，超声功率为320 W，选取乙醇体积分数为30%、55%、65%、80%。

1.2.3.2 灰绿碱蓬多糖优化组合试验

以单因素试验为前提，采用L9(34)响应面分析法，利用Design-Expert 11.0进行试验组合模拟。

表1 试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of response surface design

由表1可知，自变量分别为A乙醇体积分数(%)、B提取时间(min)、C超声功率(W)和D提取温度(℃)，以-1，0，1分别表示高、中、低3个不同水平。试验结果以多糖提取得率为响应值(Y)，确定以上4个因素对碱蓬多糖提取的单独影响和最优组合，结合实际条件优化得到热水浸提碱蓬多糖的工艺参数。

1.2.4 灰绿碱蓬多糖的脱色研究

1.1.3 试剂 乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)，磷酸二氢钾(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)，甲醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水。小檗碱标准品(批号1161116-02，成都普菲德生物技术有限公司)。

1.2.4.1 HZ-800大孔树脂吸附法脱色[4]

树脂预处理：取适用的大孔树脂于去离子水中充分搅拌分散，沉淀静置后移去上层清液的悬浮小颗粒，重复此操作3～5次，测定pH为7左右，保证大孔树脂颗粒的均一性。移除清液，加入2 mol/L的NaOH溶液于40 ℃条件下搅拌2 h反应后于室温静置保存8 h，用去离子水冲洗至pH为7左右。同理，2 mol/L HCl按照上述操作(搅拌时封口)。将NaOH-H2O-HCl-H2O处理后的大孔树脂抽滤，初步脱水，真空干燥后即可使用。

取溶液体积(m/V)的0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8% HZ-800大孔树脂，与100 mL 10 mg/mL的碱蓬多糖溶液在常温条件下以 300 r/min搅拌30 min，反应后取上清液测定吸光值，计算脱色率。

1.2.4.2 过氧化氢法脱色[5]

30% H2O2配制成70%(V/V)的过氧化氢溶液。按照每100 mL 10 mg/mL的碱蓬多糖溶液的体积分数，分别加入70%过氧化氢溶液(V/V) 0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%于三角瓶中，50 ℃条件下，以80 W功率超声25 min，反应后取上清液测定吸光值，计算脱色率。

1.2.4.3 活性炭吸附法脱色[6]

活性炭吸附脱色为常规脱色法，根据报道进行修改。取食品级椰壳活性炭于去离子水中清洗若干次，去除上层悬浮颗粒，烘干后即可使用。分别取0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%质量分数的活性炭加入到100 mL 10 mg/mL的碱蓬多糖溶液中，调节pH至6.3，温度为40 ℃，搅拌反应1 h，测定吸光值，计算脱色率。

1.2.4.4 复合皂土络联法脱色[7]

复合皂土制备：取500 g皂土加入1 L水，剧烈搅拌使其充分分散于溶剂体系，静置后除去上层悬浮颗粒、结块，抽滤得水洗皂土。将水洗后的洁净、均匀皂土分散于10% H2SO4，搅拌均匀后煮沸30 min进行酸化改性，在恒温水浴锅95 ℃条件下坐浴6 h，每1 h搅拌1次。反应后的体系放置冷却至室温，多次水洗、抽滤并用饱和Na2CO3调节pH 至5.3～5.5，过夜保存后水洗抽滤，110 ℃条件下烘干至恒重，超微粉碎至200目，即为酸改性皂土。重复以上操作，将溶剂替换为7%的十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)和1%的聚丙烯酰胺溶液中，无需调节pH，静置过夜，烘干粉碎后，即为复合皂土。

分别取溶液体积(m/V)的0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%复合皂土，加入到100 mL 10 mg/mL的碱蓬多糖溶液中，在40 ℃、300 r/min条件下搅拌30 min，反应后静置室温于10000 r/min离心10 min，取上清液测定吸光值，计算脱色率。

1.2.4.5 提取率计算

(2)

式中：A为样品未脱色之前的吸光值；Ax为样品脱色之后的吸光值；θ为脱色率。

2 结果与分析

2.1 灰绿碱蓬物质成分含量

表2 各物质成分含量Table 2 Content of various substances mg/g

注：“-”表示未测定。

由表2可知，灰绿碱蓬全植株脂肪含量极少，含有部分蛋白质，叶片中的总黄酮、总皂苷和总糖含量较多。

2.2 灰绿碱蓬多糖单因素提取试验结果与分析

2.2.1 提取温度对碱蓬多糖提取得率的影响

提取温度是影响多糖得率的一个重要因素，适宜的温度有助于提高植物细胞内物质溶出速度和提高多糖溶解度。

图1 提取温度对碱蓬多糖提取得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由图1可知，随着温度逐渐升高至75 ℃，多糖得率逐渐升高，此时多糖得率最高，为1.89%。温度继续升高，多糖得率明显下降。这一现象的原因极有可能是过高的温度使溶出的多糖结构被破坏。因此，提取温度选择75 ℃合适。

2.2.2 提取时间对碱蓬多糖提取得率的影响

在一定料液比条件下，随着提取时间的延长，溶液中溶质的饱和度会达到峰值，在此之后将不再增高。

图2 提取时间对碱蓬多糖提取得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由图2可知、当温度确定，溶解度一定时，提取时间达到50 min时，体系的多糖含量达到最大，之后多糖提取得率随着时间的延长将不再变化。提取时间选取50 min适宜。

2.2.3 超声功率对碱蓬多糖提取得率的影响

当超声波作用于溶液系统时，由于体系存在张力弱区，溶质在超声波作用下化学键及结构将会被反复断裂、闭合，使其与物料不断摩擦碰撞[8]。

图3 超声功率对碱蓬多糖提取得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由图3可知，当超声功率为320 W时，多糖浸出效果最好，提取得率最高。当超声功率逐渐增大，多糖得率逐渐下降，原因可能是过高强度的超声环境对结构化学键造成破坏，糖苷键断裂，造成多糖结构被破坏。

2.2.4 乙醇体积分数对碱蓬多糖提取得率的影响

不同比例乙醇体积分数直接影响溶液体系达到过饱和状态，从而影响多糖的得率。

图4 乙醇体积分数对碱蓬多糖提取得率的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由图4可知，乙醇体积分数低于65%时，体系溶液未达到过饱和状态，只有部分多糖析出；当乙醇体积分数达到65%时，沉淀较为完全，此时最大多糖得率为1.76%，继续增加乙醇含量，多糖得率变化缓慢。因此，最佳乙醇体积分数选择65%。

2.3 模型参数与显著性检验

根据响应面试验设计，29组优化试验的结果见表3，方差分析及拟合见表4。

表3 提取得率响应面试验的设计和结果Table 3 Design and results of response surface experiments for the extraction yield

表4 提取得率响应面回归模型的方差分析(ANOVA)Table 4 The analysis of variance (ANOVA) of the response surface regression model for the extraction yield

注：a表示0.01的显著水平，b表示0.001的显著水平。

由表3可知，试验数据由Design-Expert软件分析拟合共得到29种组合，得到A，B，C，D和Y的二次多元回归方程：Y(%)=2.07+0.057A+0.081B+0.12C+0.12D+5.000E-0.003AB-0.020AC+0.030AD+0.045BC+0.027BD+0.040CD-0.21A2-0.065B2-0.071C2-0.067D2。

由表4可知，组合试验中关于二项式回归模型的差异性统计分析的结果，P<0.0001说明模型方程在置信度为95%的程度上对多糖产率的拟合估算具有显著性。失拟项(P=0.6317)表明模型拟合良好，试验值的误差相对较小。较好的模型相关系数(R2=0.9499)表明回归方程可用于试验实际数据的分析和结果的预测期望。此外，模型变异系数(C.V.)为5.36%，得出结论：该测试可用于统计分析。 A，B，C，D和A2因素对多糖提取得率的影响极显著(P<0.0001)，而二次项B2、C2和D2则达到显著(P<0.01)水平。各因素的影响程度排列为：C>D>B>A。AC、BD、BC和CD存在着显著性异，AB、AD之间影响程度不显著(P>0.05)，即乙醇体积分数和提取时间二次交互项、乙醇体积分数和提取温度二次交互项、提取时间和提取温度二次交互项相互作用较弱，表明这些因素之间与多糖提取得率构建的关系仅为线性关系。

2.4 灰绿碱蓬多糖脱色结果分析

大孔树脂吸附脱色属于物理吸附，自身表面具有较大的比表面积，可以依靠树脂与目标物的范德华力和氢键作用力进行吸附[9,10]。吸附效果稳定，不受无机盐离子及强离子化合物存在的影响，且适用范围广，强酸强碱条件下都可以使用，特别是对有机色素吸附效果较好[11]。由图5中a可知，大孔树脂吸附脱色整体脱色率处于较高水平，且在较低浓度就可以达到80%脱色率，最佳添加量为1.8%。

图5 不同处理方式对多糖脱色效果的影响Fig.5 Effect of different treatment methods on the decolorization effect of polysaccharides

过氧化氢在特定条件下，如超声、加热条件下可以分解生成原子O[12]，即零价态，具有极强的还原性，可以将有色的物质氧化进行脱色[13,14]，这种脱色属于化学反应，属于不可逆反应。由图5中b可知，H2O2脱色效果随着添加量增加逐渐增大，当添加量达到2.3%时，体系颜色逐渐稳定。此时，体系中色素物质基本被氧化破坏，在反应中也可以明显看出体系颜色趋于浅黄色且溶液体系呈清澈状态。造成这一现象的原因不仅包括色素大分子分解，还包括部分蛋白分子、带色多酚等物质氧化破坏，这与现有的报道极为相似。

活性炭吸附属于物理吸附而非化学吸附，主要是利用微小碳粒内密布的孔洞结构来吸附极性较大的分子，具有广泛性而不具备特异筛选性，故对目标收率产物有一定的影响[15,16]。由图5中c可知，当活性炭添加量达到1.8%时，脱色效果最佳。当添加量逐渐增加，反应体系的脱色率降低，吸光值逐渐增大，造成这一现象的原因主要是过量的活性炭增加了体系的颜色深度，活性炭的色度比饱和色素的色度高。多糖的研究发现[17]，除pH、温度等条件外，活性炭添加量是影响脱色的又一重要因素。

黏土类吸附剂脱色原理根据吸附动力学模型研究，分为离子交换吸附和表观吸附两种[18]。在表观吸附方式中，微观上可以分为化学键合吸附和静电键合吸附。化学吸附可以将有色的金属离子等进行结合，形成不可逆的内络合层[19,20]；静电键合可以将大分子的色素物质吸附，无选择性地形成吸附层。研究发现，酸改性皂土对工业废水，特别是存在金属显色离子(Fe2+、Gu2+)的脱色效果较为明显。由图5中d可知，当皂土添加量达到1.8%时，色素脱除率达到峰值47.4%，随着皂土添加量的增加，反应体系脱色率变化平稳，这表明复合皂土对多糖具有一定的脱色效果，但还未能完全脱除色素。脱色效果不足之处可能是因为大分子色素蛋白与糖侧链结合，降低了皂土吸附效果。

2.5 响应面验证试验及脱色方式选择

选择活性炭、HZ-800大孔吸附树脂、过氧化氢和复合皂土的最佳脱色工艺，此时的多糖保留率将影响产物得率。比较活性炭脱色最佳用量1.8%，大孔树脂脱色最佳用量1.8%，过氧化氢最佳用量2.3%和复合皂土最佳用量1.8%时，4种脱色方式的多糖保留率差异。响应面提取多糖验证试验及脱色方式选择见表5。

表5 脱色效果与多糖保留率Table 5 Decolorization effect and polysaccharide retention rate %

由表5可知，H2O2脱色法损失多糖较多，活性炭和复合皂土法脱色效果远远低于HZ-800大孔树脂。因此，大孔树脂法脱色为本试验最优选择方法。

根据所得理论模型数据，结合实际生产和操作条件可能性，优化数据为乙醇体积分数65%、提取时间72 min、超声波辅助功率438 W、温度85 ℃，再次优化条件下进行多次试验得到多糖提取得率为2.19%±0.13%。与理论得率相比，数据平稳，误差较小且与预测值相近，证明该响应面提取多糖的分析方法可行、数据可靠，具有理论和实际应用价值。

3 结论

碱蓬多糖是一种具有维持细胞渗透压，防止水分流失的非还原性糖，由于其独特的生物特性被人们逐渐认知。高渗地区生长环境具有高浓度的盐离子含量，未脱盐的粗糖使其成为一种集调味品与功能性添加剂为一体的食品添加剂。探究适合高盐成分多糖的脱盐方式及其参数，可以对肉类、果蔬、味精等增鲜调味品提供应用的理论基础。

试验理论方程模型较好地模拟了提取温度、提取时间、超声功率、乙醇体积分数和多糖提取率之间的关系，试验数据准确，实际提取结果与理论预测值相近。结合实际生产情况确定了乙醇体积分数65%、提取时间72 min、超声功率438 W、提取温度85 ℃为最佳提取参数，此时碱蓬多糖提取得率达到2.19%±0.13%。多糖脱色研究中，考虑在最低脱色剂使用量和脱色效果最优情况下，选择HZ-800大孔树脂作为碱蓬多糖的脱色方式，此时大孔树脂脱色最佳用量为1.8%，脱色率为95.51%，多糖保留率为79.62%。