红心萝卜色素分布及其抑菌特性分析

张梓涵,蔡 铖,李 恒,朱益源,高 健,陶婷婷,丁 超,*

(1.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023; 2.长江师范学院生命科学与技术学院,重庆涪陵 408100; 3.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所,省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室,江苏南京 210014)

萝卜作为一种好培育、成本低的经济作物,可以通过有效的加工利用可以提升附加值并增加农民收入。中国的涪陵地区地理环境独特,在当地产出的常见红心萝卜有北雁红心萝卜、胭脂萝卜、龙泉红心萝卜、红心一号萝卜等,均有心皮全红的特性[1]。红心萝卜色素是一种天然色素,主要是天竺葵素葡萄糖苷衍生物[2]。红心萝卜提取出的色素含量高、质量好[3-4],为市场提供了更为物美价廉的天然安全色素选择,对红心萝卜色素提取利用可提高该农产品附加值。

目前我国已采用多种技术提取红心萝卜色素,包括溶剂提取法、超声波辅助提取法、超临界CO2提取法等[5-6],但红心萝卜内部色素分布规律尚不明确。通过色素分布研究可实现红心萝卜分部利用,实现组合收益。因此,本文对4种红心萝卜进行色素的提取和含量测定,研究其色素分布,有助于对红心萝卜不同部位色素的选择性利用,并检测色素的稳定性和探究其抑菌特性,利于红心萝卜的生产工艺优化和深加工。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

北雁红心萝卜(重量300～450 g,最粗部位直径4～6 cm)、胭脂萝卜(重量200～350 g,最粗部位直径4～5 cm)、龙泉红心萝卜(重量500～550 g,最粗部位直径9～11 cm)、红心一号萝卜(重量200～350 g,最粗部位直径4～5 cm) 重庆长江师范学院;大肠杆菌(CICC10254)、金黄色葡萄球菌(CICC21600) 本实验室提供;甲醇 色谱纯,ROE scientific inc.;柠檬酸、抗坏血酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、三氯化铁、硫酸铝、盐酸、氯化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;食盐 未加碘精制盐,氯化钠含量≥98.50%，中盐;蔗糖 太古。

TP-214电子天平 丹佛仪器(北京)有限公司;PHS-3CpH计 上海精密科学仪器有限公司;SB25-12DTDN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;SF-CJ-2A净化工作台、GNP-9160型隔水式恒温培养箱 上海三发科学仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;TG16-WS高速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司;LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;旋转蒸发仪 德国Heidolph;U-3900紫外可见分光光度计 日本日立。

1.2 实验方法

1.2.1 色素的提取 随机选取北雁红心萝卜、胭脂萝卜、龙泉红心萝卜、红心一号萝卜,处理收集需测定色素的部分,准确称取各部位待测样品10.00 g于三角瓶中,立即加入60 mL 0.01% HCl的甲醇溶液,密闭。用超声波辅助提取法,设置温度30 ℃,时间40 min[5]。后进行过滤,收集滤液,滤渣进行二次提取,直到颜色几乎接近无色,合并滤液。将滤液在45 ℃的条件下旋转蒸发完全后,用0.01%的HCl水溶液对蒸馏烧瓶进行冲洗,溶解壁内全部色素后倒入离心瓶。浓缩液在4000 r/min下离心10 min,取上清液,因红心萝卜色素在弱酸(pH=6.0)条件下保色度好[4],用0.01%的HCl溶液定容到25 mL保存。后续的实验均用0.01%的HCl溶液10倍稀释作为各品种萝卜色素测定液a。

1.2.2 色素分布

1.2.2.1 色素总含量 选取pH示差法更为精确地确定总色素含量。根据熊玥等[4]研究,可知萝卜红色素为天竺葵素的葡萄糖苷衍生物,结合Fuleki等[7]的方法进行改进。取40 mL测定液a,平均分成两份,每份20 mL,分别用pH=1.0、pH=4.5的缓冲液定容至100 mL,静置后在最大吸收波长530 nm处测定其吸光值,计算其色素含量并进行比较。

式中:C为色素含量(mg/g);A0和A1分别 pH=1.0、pH=4.5时色素在530 nm 处的吸光度;V为提取液总体积(mL);n 为稀释倍数;M为天竺葵素-3-槐二糖苷相对分子量(648.5);ε为消光系数(30200);m为样品质量(g)。

1.2.2.2 不同部位色素含量分布比较 选用紫外分光光度法测定,进行不同部位的比较,最大吸收波长为530 nm。萝卜的根头至叶柄部位为上部,根颈至根头部位为中部,根颈至真根部位为下部,还选定了外皮和叶片的部分[8],向各部位稀释后的测定液中加入0.10 mol/L pH3.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液调节pH并定容,测定红心萝卜在波长530 nm处的吸光度,并比较其差异。

1.2.3 色素稳定性

1.2.3.1 光照稳定性 取胭脂萝卜色素提取液5 mL于三支试管中,分别于室温避光、室温24 h有光照、室温自然光条件下放置总共144 h,在4、24、48、96和144 h时,测在波长530 nm处的吸光度,并观察色素颜色的变化。

1.2.3.2 热稳定性 取五只试管,取5 mL胭脂萝卜色素提取溶液,加入5 mL蒸馏水,分别设置在室温(25 ℃)、40、60、80 ℃下进行实验[9],放置避光2 h,每隔1 h测量其在530 nm处的吸光度,同时观察色素颜色变化。

1.2.3.3 酸碱稳定性 取5 mL胭脂萝卜的色素提取液,用0.2 mol/L的HCl、0.1 mol/L的NaOH配制pH为3、5、7、9、11、13的缓冲液[9],准确移取5 mL缓冲液于色素提取液中,室温下避光放置4 h,每隔2 h分别测定其在波长530 nm处的吸光度,同时观察色素颜色变化。

1.2.3.4 金属离子稳定性 取5 mL胭脂萝卜色素提取液,分别加入5 mL 0.001、0.002、0.003 mol/L的氯化钙、三氯化铁、氯化铝以得到Al3+、Fe3+、Ca2+,另取一支加5 mL蒸馏水,室温下放置12 h,最后分别测定其在530 nm处的吸光度,目测颜色变化。

1.2.3.5 氧化还原特性 取5 mL胭脂萝卜色素提取液,分别加入5 mL浓度为1%、2%、3%的H2O2、Na2SO3溶液,另取一支加5 mL蒸馏水,室温下避光放置2 h,测定其在530 nm的吸光度。

1.2.3.6 外源食品添加剂稳定性 取5 mL胭脂萝卜色素提取液,分别加入5 mL 0.003 mol/L的蔗糖、食盐、柠檬酸和维生素C(抗坏血酸)溶液[10],另取一支加5 mL蒸馏水,室温下避光放置12 h,分别测定其在530 nm处的吸光度。

1.2.4 色素的抑菌特性

1.2.4.1 抑菌特性探究 选用一种革兰氏阴性菌和一种革兰氏阳性菌进行试验,金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)经培养增殖,取胭脂萝卜色素测定液a,经pH示差法计算浓度后,稀释调整至3 mg/mL,作为胭脂萝卜色素测定液b,用滤纸片法进行色素的抑菌性探究实验[11],分别设置扩散组与非扩散组[12],扩散组在接种后在4 ℃冰箱内放置24 h,使胭脂萝卜色素测定液b充分扩散后再进行常规培养,每组均设置无菌生理盐水对照组。测量抑菌圈的大小,以此判定胭脂萝卜色素的抑菌性能。

1.2.4.2 最小抑菌浓度(MIC) 取胭脂萝卜色素测定液a与各菌液按比例加入试管中,使试管中的抑菌剂(即胭脂萝卜色素)的质量浓度梯度为50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%、0.39%、0.19%、0.09%、0.05%和0,后在(37±1) ℃培养箱内进行培养,在24 h后观察比较,培养基中没有细菌生长的最低浓度即为最小抑菌浓度。

1.3 数据处理

每组条件下的实验均设置对照实验,每个样品重复3次。通过PASW Statistics 18软件进行T检验,并进行数据评价。

2 结果与分析

2.1 色素分布

2.1.1 色素总含量比较 图1以色素含量最小的北雁红心萝卜作为标准,比较了其余3种红心萝卜色素的含量,可以看出胭脂萝卜色素含量显著高于其他品种的萝卜(P<0.05)。根据pH试差法得出胭脂萝卜色素含量为0.039 mg/g。相较于其他果蔬,如红苋菜花青素(0.035 mg/mL[13]),胭脂萝卜的色素含量基本一致,但作为根茎类食用原料,单位面积产量高,因此萝卜红色素可以作为色素加工的重要原料。

图1 四种红心萝卜的色素含量比值Fig.1 Pigment absorbance of differentparts of four kinds of red radish

2.1.2 不同部位色素含量分布比较 紫外分光光度法的结果(图2)表明,每种萝卜色素分布的差异性,北雁红心萝卜标准品底部色素含量显著高于上部和中部,而龙泉红心萝卜是上部色素含量明显高于中部和底部的色素含量。通过整体数据的差异显著性分析可得,在测四种红心萝卜的外皮与其他部位吸光值的差值平均值是0.040,在红心萝卜这四个品种中,外皮的色素均为含量最高。叶中的红色素含量普遍偏低,但提取叶中的红色素能做到废物利用,经济价值较高。

图2 四种红心萝卜不同部位色素吸光值Fig.2 Ratio of pigment content of4 kinds of carrots in different parts

2.2 红心萝卜色素稳定性

2.2.1 光照稳定性和热稳定性 对144 h储藏期内色素的稳定性进行监测,图3中可以看出,日光和灯光照射条件下,吸光值从24 h之后下降速度变快,避光条件下的色素在观测期内变化不大(吸光值变化在0.002之内)。在日光和灯光处理比较,日光条件下变动相对较大,日光处理的吸光值在48 h左右开始低于灯光处理的数据。但图3看出,无论是日光还是灯光,在短时间内,对胭脂萝卜色素的影响仍有限,吸光值最终变化范围在0.04之内。在24 h出现的灯光和日光条件下的吸光值短暂升高,推测是溶剂挥发导致。根据图4可以看出在室温至40 ℃之间,胭脂萝卜色素较为稳定,在60 ℃之后,色素吸光值出现更为明显的下降,可见在室温到40 ℃的温度区间,色素对温度变化并不敏感,对高温较为敏感。

图3 不同光照条件下的色素吸光值Fig.3 Pigment absorbance underdifferent light conditions

图4 不同温度下色素吸光值Fig.4 Pigment absorbance at different temperatures

2.2.2 pH稳定性 在pH从3～13变动的同时,吸光值有明显的变化(表1),与中性条件相比,色素在强酸(pH≤5)或强碱(pH≥11)条件下,尤其是在强酸性条件下吸光度值变动极大,可以推测是由于强酸和强碱破坏了色素的结构,导致吸光度值的变化,所以胭脂萝卜色素应在中性环境(pH≈7)下使用。

表1 不同pH下的色素吸光值Table 1 Pigment absorbance at different pH values

2.2.3 金属离子稳定性 胭脂萝卜提取液在不同金属离子处理12 h后,各溶液的吸光度均有变化(表2)。肉眼观察溶液颜色时,加Fe3+的溶液颜色由紫红色转变为棕红色,加Al3+后原紫红色变得更为鲜艳,而Ca2+对胭脂萝卜色素的影响是最小的。由此说明,胭脂萝卜红色素的抗Ca2+的干扰能力强,抗Fe3+、Al3+的干扰能力较弱,故在使用时应注意减少暴露在Fe3+、Al3+金属离子中,尽量避免使用铁、铝制容器储藏。

表2 常见金属离子处理后色素的吸光值Table 2 Pigment absorbance after common metal ion treatment

2.2.4 氧化剂和还原剂稳定性 当胭脂萝卜色素与H2O2共存时,吸光值最低值出现在浓度2%时的0.037±0.005,影响较大,在与Na2SO3共存时,吸光值在2%时为0.105±0.009,相比较之下,H2O2试剂处理下的吸光度明显变化更大,与空白对照样吸光度相差最大约为0.406。所以,可以推测胭脂萝卜色素的耐还原能力比耐氧化能力强。

表3 氧化剂和还原剂处理后色素的吸光值Table 3 Pigment absorbance after treatmentwith oxidant and reducing agent

2.2.5 常见食品添加剂对色素稳定性的影响 含有常见食品添加剂的溶液12 h后吸光度值变化程度不同(图5),与空白组相比，食盐对色素的影响不显著,说明胭脂萝卜色素对盐的耐受度较大;而蔗糖相比于食盐,对色素吸光值的影响幅度较为明显,12 h后吸光值下降大于0.1,可见此色素对糖的耐受度偏低,因此在应用此类色素时,需要关注多糖的添加。相反,柠檬酸和维生素C这类抗氧化剂,对色素有明显的护色作用[14],可用作此色素的维稳剂。

图5 常见食品添加剂处理后色素的吸光值Fig.5 Pigment absorbance after treatmentof common food additives

2.3 抑菌特性

未扩散时胭脂萝卜色素测定液对大肠杆菌的抑菌圈大小为(7.18±0.30) mm,而大肠杆菌在无菌的生理盐水纸片下,抑菌圈大小仅有(4.12±0.12) mm。扩散后,胭脂萝卜色素测定液和无菌生理盐水处理大肠杆菌的抑菌圈大小都有增大,胭脂萝卜色素测定液处理下抑菌圈由未经扩散的(7.18±0.30) mm扩大为扩散后的(9.01±0.45) mm,说明扩散后抑菌效果更好;同时,扩散后胭脂萝卜色素测定液处理下大肠杆菌的抑菌圈大小仍然大于无菌生理盐水处理下大肠杆菌的抑菌圈大小(5.08±0.15) mm。对于金黄色葡萄球菌,抑菌圈的大小也有相同的规律,但是经扩散和未经扩散处理下,胭脂萝卜色素测定液处理下的金黄色葡萄球菌抑菌圈比相同情况下的大肠杆菌抑菌圈小,说明胭脂萝卜色素测定液对大肠杆菌的抑菌效果良好。综合其他数据可以得出,胭脂萝卜色素对常见的致病性细菌,如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌,均有不同程度的抑制效果,且经扩散处理后的效果更为明显。

最小抑菌浓度(MIC)实验结果由表5所示,胭脂萝卜色素在6.25%～50的质量浓度之间时,对两个菌种均有较为良好的抑菌效果,胭脂萝卜色素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用在3.13%～6.25%的质量浓度之间开始出现转折,即在最小质量浓度为6.25%时,胭脂萝卜色素对金黄色葡萄球菌就有良好的抑菌效果,而对大肠杆菌的抑菌作用在1.56%～3.13%之间开始出现转折,即在最小质量浓度为3.13%时对大肠杆菌就有良好的抑菌效果;对比看出相对金黄色葡萄球菌,胭脂萝卜色素对大肠杆菌的抑菌效果更好,与抑菌圈实验结果相似。

表4 胭脂萝卜色素作用下培养皿中的抑菌圈(mm)Table 4 Bacteriostatic ring in petri dish under the action of red radish pigment(mm)

表5 最小抑菌浓度Table 5 Minimum inhibitory concentration

备注:“+”表示观察到有微生物生长,“-”表示观察到无微生物生长。在质量浓度逐渐降低的过程中,培养液也愈加浑浊,胭脂萝卜色素对大肠杆菌的抑菌作用从1.56%开始到0.19%呈现了逐渐减弱的状态,从0.19%开始与0差别较小,微生物生长情况几乎未受影响;胭脂萝卜色素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用从3.13%开始到0.78%逐渐减弱,从0.39%开始与0差别较小。

3 结论

通过对北雁红心萝卜、胭脂萝卜、龙泉红心萝卜、红心一号萝卜等4种萝卜色素分析,发现胭脂萝卜色素总量最高(0.039 mg/g),相比其他果蔬,色素含量具有较高的应用价值。萝卜个体内部色素存在差异,萝卜皮中的色素含量显著高于萝卜内部其他部位(P<0.05)。提取色素对高温(≥60 ℃)较为敏感,在pH=7时色素较稳定,抗Fe3+、Al3+的干扰能力较弱;耐还原能力比耐氧化能力强;柠檬酸和维生素C对色素有保色作用,蔗糖和食盐对色素稳定性影响不显著,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。食品加工和贮运过程中如何提高胭脂萝卜色素稳定性及工业化生产仍需进一步研究。