四川地区不同疾病谱慢性HBV感染者病毒基因分型与细胞免疫及凝血功能的关系

李守娟， 王 丽， 陈 竹， 胡朝霞， 王 磊， 吴 蓓， 朱 丽， 段 萌

成都市公共卫生临床医疗中心 肝病科， 成都 610066

Association of genotype with cellular immunity and coagulation function in chronic hepatitis B virus infection patients with different disease spectrums in Sichuan, China

LIShoujuan,WANGLi,CHENZhu,etal.

(DepartmentofHepatology,ChengduPublicHealthMedicalCenter,Chengdu610066,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the genotype distribution of chronic hepatitis B virus (HBV) infection patients with different disease spectrums in Sichuan, China, as well as the association of genotypes with cellular immunity and coagulation function.MethodsA total of 543 patients with chronic HBV infection who were hospitalized in Chengdu Public Health Medical Center from January 2015 to June 2017 were enrolled, among whom there were 31 chronic HBV carriers, 285 patients with chronic hepatitis B (CHB), 77 patients with severe hepatitis B, 81 patients with hepatitis B cirrhosis, and 69 patients with hepatocellular carcinoma (HCC). Blood samples were collected; gene microarray was used to determine the genotypes of HBV DNA, and T lymphocyte subsets and coagulation function were measured. An analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the SNK-qtest was used for further comparison between two groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups.ResultsAmong the 543 patients with chronic HBV infection, 400 (73.66%) had type B infection, 123 (22.65%) had type C infection, 10 (1.84%) had mixed type B and C infection, and 10 (1.84%) had mixed type C and D infection. There were no significant differences in the distribution of HBV genotypes, prothrombin time, and prothrombin activity in different disease spectrums between the patients with type B infection and those with type C infection (allP>0.05). According to the results of T lymphocyte subsets, in the severe hepatitis B group, the patients with type C infection had higher percentages of CD3+and CD3+CD4+T cells than those with type B infection; in the chronic hepatitis B group, the patients with type C infection had a higher percentage of CD3+CD8+T cells than those with type B infection; in the chronic HBV carrier group, severe hepatitis B group, and hepatitis B cirrhosis group, the patients with type C infection had a higher CD4+/CD8+ratio than those with type B infection; in the hepatitis B cirrhosis group, the patients with type C infection had lower percentages of CD3+, CD3+CD4+, and CD3+CD8+T cells than those with type B infection; in the HCC group, the patients with type C infection had lower percentages of CD3+, CD3+CD4+, and CD3+CD8+T cells and a lower CD4+/CD8+ratio than those with type B infection, with significant differences in the percentages of CD3+CD4+T cells (t=2.078,P=0.041) and CD3+CD8+T cells (t=6.672,P<0.001) between the patients with type C infection and those with type B infection in the hepatitis B cirrhosis group.ConclusionTypes B and C are the main genotypes of chronic HBV infection in different disease spectrums in Sichuan, with type B more commonly seen than type C, and there is no difference in the distribution of HBV genotypes between patients with different disease spectrums. Disorder of cellular immune function is observed in patients with chronic HBV infection, with different immune disorders in different stages of infection, and the genotype of infection is not associated with coagulation function and cellular immune function.

Keywords：hepatitis B virus; genotype; immunity, cellular; blood coagulation; Sichuan

HBV感染机体后主要通过宿主免疫机制引起肝损伤，造成HBV感染后不同临床转归的原因有病毒、环境因素、宿主遗传因素等[1]，不同的病毒基因型可能影响抗原表达而产生不同的临床表现，具有不同的流行特征及致病性。肝脏在凝血机制中占有极其重要的地位，凝血因子合成能力反映了肝细胞的功能状态。国外学者Sass等[2]认为凝血时间是判断重型肝炎预后的重要因素。不同疾病谱慢性HBV感染者基因型是否导致机体免疫功能的差异及凝血功能的改变，临床报道不多。本研究通过对四川地区慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝细胞癌患者的基因型和T淋巴细胞及凝血功能变化进行分析，以探讨不同基因型与细胞免疫及凝血功能的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015年1月-2017年6月于本院住院的四川地区(宜宾、巴中、广安、广元、成都、甘孜州、阿坝州)HBV感染者。根据患者症状、体征、实验室及影像学检查结果，将患者分为慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝细胞癌(在慢性乙型肝炎基础上发生的肝细胞癌)5组，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[3]。纳入患者均进行HBV DNA基因分型以及T淋巴细胞亚群和凝血功能检测。排除甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、药物性、代谢性等疾病。患者均签署知情同意书。

1.2 HBV DNA基因分型检测 采用基因芯片法，使用珠海赛乐奇生物技术有限公司提供的仪器及配套试剂盒，将待测不同HBV基因型的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成检测芯片，从患者血清中抽提出的HBV DNA经PCR扩增标记后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机分析确认结果。严格按照试剂盒上说明进行操作。

1.3 T淋巴细胞亚群检测 使用BECKMAN FC500流式细胞仪及配套试剂检测T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8：每个样品测定管中加入50 μl抗凝血(EDTA-K2抗凝)，各管加入10 μl三色单抗，轻微振荡混匀，室温避光放置20 min；加1 ml溶血素裂解红细胞，轻微振荡，避光10 min，接着离心弃上清2次，加PBS后上机检测。取50 μl全血加10 μl IgG1-FITC/IgG1-PE/IgGl-PE-Cy5(小鼠)，作为阴性对照，其他步骤同上。每份标本测定5000个细胞，全部数据用流式细胞仪和软件SYSTEM Ⅱ获取及分析。

1.4 肝功能及凝血功能测定 采用Labospect 008全自动生化分析仪和迈克生物生化试剂检测肝功能各项指标，包括ALT、AST、Alb、TBil。通过Sysmex CS-2000血凝仪及武汉中太生物技术有限公司血凝试剂进行PT、凝血酶原活动度(PTA)检测。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入543例HBV感染者，年龄18～70岁，平均(41.25±13.67)岁，其中男416例，女127例。纳入患者中慢性HBV携带者31例，慢性乙型肝炎(包括轻、中、重度)285例，重症乙型肝炎(包括早、中、晚期)77例，乙型肝炎肝硬化81例，肝细胞癌69例。其中B型400例，占73.66%；C型123例，占22.65%；B、C混合型10例(汉族)，C、D混合型10例(汉族4例，藏族6例)，各占1.84%。各组均以B型、C型常见，B型为主，可见极少部分B、C混合型及C、D混合型，没有发现A、E、F、G、H、I、J型(表1)。

表1 不同类型HBV感染者的基因分型情况[例(%)]

2.2 B/C不同基因型慢性HBV感染者肝功能测定 因B、C混合型及C、D混合型例数较少，故仅选取B型和C型共523例慢性HBV感染者进行肝功能测定。慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝细胞癌各组中HBV基因型的分布无差异(χ2=8.770，P=0.067)。肝功能检测结果显示，各组内B型与C型患者比较，慢性乙型肝炎组Alb(t=2.073，P=0.039)、乙型肝炎肝硬化组ALT(t=2.851，P=0.006)和AST(t=3.182，P=0.002)水平差异均有统计学意义，其余指标组内比较均无统计学差异(P值均>0.05)。同一基因型不同分组间肝功能比较显示，B基因型中慢性HBV携带者ALT、AST、TBil、Alb水平与其他组差异均有统计学意义(P值均<0.05)；B/C基因型中，重症乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组、肝细胞癌组比较，ALT、AST、TBil水平差异均有统计学意义(P值均>0.05)；而乙型肝炎肝硬化组与肝细胞癌组各项肝功能指标比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

2.3 B/C不同基因型慢性HBV感染者凝血及T淋巴细胞亚群测定 各组内B型与C型患者比较，仅乙型肝炎肝硬化组CD3+CD4+(t=2.078，P=0.041)、CD3+CD8+(t=6.672，P<0.001)差异有统计学意义，其余指标组内比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。同一基因型不同组间凝血功能检测结果显示，慢性乙型肝炎组与重症乙型肝炎组、重症乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组和肝细胞癌组相比，PT、PTA差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而慢性HBV携带者与慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者与肝细胞癌患者凝血功能比较均无差异(P值均>0.05)。同一基因型不同组间T淋巴细胞亚群检测结果显示，B基因型中慢性乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组及肝细胞癌组、重症乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组及肝细胞癌组比较，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/ CD8+差异均有统计学意义(P值均<0.05)，且乙型肝炎肝硬化患者CD3+CD8+数量明显高于肝细胞癌患者(P<0.05)。C基因型中慢性HBV携带者与重症乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组及肝细胞癌组比较，CD3+、CD3+CD4+数量差异均有统计学意义(P值均<0.05)，重症乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组及肝细胞癌组比较，CD3+、CD3+CD4+数量差异亦均有统计学意义(P值均<0.05)；慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎3组分别与乙型肝炎肝硬化组和肝细胞癌组比较，CD3+CD8+数量差异均有统计学意义(P值均<0.05)；CD4+/CD8+各组间比较均无统计学差异(P>0.05)(表3)。

3 讨论

目前根据HBV全基因序列差异>8%或S基因片段差异>4%分为A～J共10个基因型[4]。HBV基因型分布具有明显的地域特征，在我国主要是B型和C型[5-6]，也存在A型、D型及B和C型混合感染[7]。胡朝辉等[8]报道四川地区HBV基因型以B、C型为主，而B型占优势地位。本研究结果显示，纳入543例HBV感染者中B型占73.66%，C型占22.65%，B、C混合型及C、D混合型各占1.84%，没有发现A、E、F、G、H、I、J型。笔者对523例B/C不同基因型各疾病谱慢性HBV感染者进行比较，发现各组中HBV基因型的分布无差异，肝功能检测中慢性乙型肝炎组Alb，乙型肝炎肝硬化组ALT、AST比较差异有统计学意义，表明在HBV导致的有明显肝脏炎症及纤维化程度较重的肝脏疾病谱中，B型比C型更易引起炎症反应，但C型患者肝脏合成能力较差。同一基因型各疾病谱间比较结果显示，B基因型中慢性HBV携带者与各组比较肝功能指标均有差异(P值均<0.05)；B/C基因型除Alb外，其余指标在重症乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组、肝细胞癌组比较中差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而乙型肝炎肝硬化组与肝细胞癌组各项指标差异无统计学意义(P值均>0.05)，表明在HBV所致肝细胞坏死程度与引起不良临床结局方面B与C基因型之间无差异。

表2 B/C不同基因型慢性HBV感染者肝功能检测结果

注：与慢性HBV携带者比较，1)P<0.05；与慢性乙型肝炎组比较，2)P<0.05；与重症乙型肝炎组比较，3)P<0.05。

表3 B/C不同基因型慢性HBV感染者凝血功能及T淋巴细胞亚群检测结果

组别例数CD3+CD4+(个/μl)B型C型CD3+CD8+(个/μl)B型C型CD4+/CD8+B型C型慢性HBV携带者31746.11±78.09734.25±61.87409.93±68.58365.50±40.911.85±0.242.02±0.10慢性乙型肝炎278577.20±204.631)554.97±150.411)401.43±179.54420.21±217.741.57±0.521.50±0.52重症乙型肝炎75485.27±180.021)2)500.19±114.991)309.13±205.951)2)292.10±123.791.90±0.751.94±0.75乙型肝炎肝硬化77377.19±243.581)2)3)266.96±131.941)2)3)223.09±159.631)2)3)135.45±2.511)2)3)2.15±1.202)3)2.28±2.02肝细胞癌62313.00±124.421)2)3)306.00±54.041)2)3)152.23±54.341)2)3)4)144.33±23.401)2)3)2.19±0.912)3)2.14±0.32F值34.17031.92329.16631.52312.2873.436P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.369

注：与慢性HBV携带者比较，1)P<0.05；与慢性乙型肝炎组比较，2)P<0.05；与重症乙型肝炎组比较，3)P<0.05；与乙型肝炎肝硬化组比较，4)P<0.05。

肝脏是合成凝血因子的主要场所。随着肝损伤程度的加重，慢性乙型肝炎患者凝血功能有降低的趋势，特别是对于慢性重型乙型肝炎患者和肝硬化患者[9]。肝病患者凝血因子的变化对合理判断预后具有重要参考价值[10]。本研究发现，同一基因型不同疾病谱间比较，随着肝损伤的加重，PT延长，PTA降低，尤其是重症乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者更明显，与上述研究[9]结果一致。而同一疾病谱内B基因型患者PT延长及PTA降低程度虽比C基因型患者明显，但均无统计学差异(P值均>0.05)。

外周血T淋巴细胞的数量、功能和各亚群构成比的变化反映了机体的细胞免疫状态。HBV感染后，患者主要依靠机体细胞毒效应与非细胞毒效应两种免疫机制清除病毒。其中T淋巴细胞参与的细胞毒效应起主导作用。研究[11]显示慢性乙型肝炎患者存在细胞免疫功能紊乱。本研究中，各疾病谱内CD3+、CD3+CD4+数量在重症乙型肝炎组，CD3+CD8+数量在慢性乙型肝炎组，CD4+/CD8+在慢性HBV携带者组、重症乙型肝炎组及乙型肝炎肝硬化组C型均高于B型，而乙型肝炎肝硬化组CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+数量与肝细胞癌组CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+数量、CD4+/CD8+则是C基因型患者低于B型，且仅乙型肝炎肝硬化患者CD3+CD4+、CD3+CD8+数量比较差异有统计学意义(P值均<0.05)，说明肝硬化患者C型较B型CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞受损严重，以致其免疫功能更低下[12]。同一基因型不同疾病谱间比较结果显示，B基因型中随着病情的加重，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+数量逐渐减少，CD4+/CD8+仅慢性乙型肝炎组低于慢性HBV携带者，其余各组均高于慢性HBV携带者且逐渐上升，其中慢性乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组及肝细胞癌组比较、重症乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组及肝细胞癌组比较，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+数量和CD4+/CD8+差异均有统计学意义(P值均<0.05)，且乙型肝炎肝硬化组与肝细胞癌组CD3+CD8+数量比较差异亦有统计学意义(P值均<0.05)，说明在慢性HBV感染的过程中，机体的免疫细胞在清除病毒过程中造成自身不同程度损耗，致使患者免疫力低下，可能会进一步促发乙型肝炎肝硬化状态下的肝细胞恶变[12]。C基因型中，肝细胞癌组CD3+、CD3+CD4+数量高于乙型肝炎肝硬化组，其余各组随病情的进展逐渐减少但均高于肝细胞癌组；慢性HBV携带者分别与重症乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组及肝细胞癌组比较，重症乙型肝炎组分别与乙型肝炎肝硬化组、肝细胞癌组比较，CD3+、CD3+CD4+数量差异均有统计学意义(P值均<0.05)；CD3+CD8+数量变化从大到小依次为：慢性乙型肝炎>慢性HBV携带者>重症乙型肝炎>肝细胞癌>乙型肝炎肝硬化，且慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎、重症乙型肝炎3组分别与乙型肝炎肝硬化和肝细胞癌组比较，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而CD4+/CD8+变化顺序为：乙型肝炎肝硬化>肝细胞癌>慢性HBV携带者>重症乙型肝炎>慢性乙型肝炎，但各疾病谱间比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。说明在慢性HBV感染的不同阶段，机体的免疫紊乱各不相同[12]。

综上所述，四川地区不同疾病谱慢性HBV感染者基因分型以B型、C型常见，B型为主；各疾病谱中B、C基因型的分布无差异。同一基因型不同疾病谱间比较，随着肝损伤的加重，PT延长，PTA降低，尤其是重症乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者更为明显，同一疾病谱内B基因型PT延长及PTA降低程度虽比C型明显，但均无统计学差异(P值均>0.05)。在慢性HBV感染者体内存在细胞免疫功能的紊乱，且随感染的不同阶段，机体的免疫紊乱各不相同，除乙型肝炎肝硬化患者C型较B型CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞受损严重有统计学意义，其余各组CD3+、CD4+/CD8+组内比较均无统计学差异，提示HBV基因型是否可导致不同疾病谱慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的差异有待进一步研究。