我国新生儿遗传代谢病串联质谱切值调查分析

何法霖， 林 博， 王 薇， 钟 堃， 袁 帅， 杜雨轩， 王治国

（1.北京医院 国家老年医学中心 卫生健康委临床检验中心/北京市临床检验工程技术研究中心，北京 100730；2.浙江大学计算机科学与技术学院，浙江 杭州 310013）

先天代谢异常又称遗传代谢病，是指由于基因突变引起酶活性下降、细胞膜功能异常或受体缺陷导致机体生化代谢紊乱，造成反应底物、中间或旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏，引起一系列临床症状的一组特殊的疾病[1-2]。遗传代谢病发病机制复杂，临床表现多样且缺乏特异性，诊断主要依赖对患儿血、尿及其他体液中特异性代谢物质的实验室检测。串联质谱技术1次可检测40多种指标，筛查数十种氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病，越来越多的遗传代谢病被诊断[3]。除开展室内质量控制和参加室间质量评价（external quality assessment，EQA）之外，保证筛查质量另一重要环节是筛查指标切值的设置，不恰当的切值会降低筛查效率、浪费医疗资源，并增加患者精神负担[4]。国家卫生部临床检验中心针对亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、游离肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十四烷酰希酰肉碱、棕榈酰肉碱、十八碳酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱和3-羟基-异戊酰肉碱共16项指标切值的现状进行调查分析，旨在为遗传代谢病串联质谱切值的质量控制提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

2018年参加国家卫生健康委临床检验中心新生儿串联质谱筛查氨基酸和酰基肉碱EQA计划的实验室共151家，包括新生儿筛查中心、妇幼保健院及第三方检测公司，涵盖全国31个省自治区、直辖市。

1.2 研究方法

收集151家实验室EQA计划相关信息，包括：实验室编码、单位名称、所在地区、指标切值、切值来源、方法学原理、仪器、试剂盒校准品及是否修改过切值。

1.3 统计学方法

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 19.0软件对数据进行整理分析，经Kolmogorov-Smirnov检验显示各组切值呈非正态分布。对16项指标的切值分布情况进行描述，包括中位数、最小值、最大值、百分位数。根据方法学原理对切值进行分析，并用秩和检验比较不同方法的组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生儿串联质谱筛查氨基酸和酰基肉碱16项指标切值来源分析

151家实验室中，上报有效数据的实验室为114家，16项指标的切值来源所占比例基本相同。有80家（70.18%）实验室切值来源为试剂厂家说明书；除苯丙氨酸项目外，有18家（15.79%）实验室切值位自行确定，有16家（14.04%）实验室切值来源于文献报道；苯丙氨酸项目有19家（16.67%）实验室切值为自行确定，有15家（13.16%）实验室切值来源于文献报道。49.12%～53.51%的实验室修改过切值。见表1。

表1 114家临床实验室16项指标切值修改情况

2.2 新生儿串联质谱筛查氨基酸和酰基肉碱16项指标切值描述分析结果

使用串联质谱筛查氨基酸和酰基肉碱16项指标按检测方法分为衍生化检测（24家）、非衍生化检测（90家），按不同方法分组进行切值分析。其中瓜氨酸、游离肉碱分为2个切值，游离肉碱低值预示原发性系统肉碱缺乏症，游离肉碱高值预示肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症；瓜氨酸低值预示鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏、N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症和氨甲酰磷酸合成酶缺乏症，瓜氨酸高值预示瓜氨血症I型、精氨酰琥珀酸尿症及希特林蛋白缺乏症。结果显示，16项指标不同检测方法切值差异显著（P＜0.05）。同一种检测方法实验室的切值也存在差异，采用衍生法检测的实验室间切值变异系数为25.26%～172.05%，采用非衍生法检测的实验室间切值变异系数为18.15%～200.92%，其中苯丙氨酸衍生法和非衍生法实验室间的变异系数最小，3-羟基-十六碳酰肉碱衍生法和非衍生法实验室间的变异系数最大，除瓜氨酸高值、亮氨酸、十四烷酰希酰肉碱和3-羟基-十六碳酰肉碱外，其他各项指标切值衍生法变异系数均大于非衍生法变异系数。见表2。

表2 串联质谱不同方法切值的统计结果

2.3 不同筛查方法切值离散程度

根据筛查实验室所用实验方法以及开展串联质谱以来是否修改过切值，绘制复合箱线图。结果显示，衍生法未修改切值的离散程度比修改过切值的离散程度更大。非衍生法除瓜氨酸低值外，其他指标未修改切值数据组与修改切值数据组离散程度相当，而瓜氨酸低值未修改过切值的数据比修改切值的数据离散程度大。见图1。

图1 16项指标按不同分类统计分析图

3 讨论

本研究涉及28个省市的141家开展串联质谱新生儿遗传代谢病筛查项目的临床实验室，能较全面地反映我国串联质谱新生儿遗传代谢病筛查切值设置现状。从切值来源看，大部分实验室选择了试剂厂家说明书，14%的实验室由自己确定，约50%的实验室从未修改过切值。从筛查的方法看，78%（90/114）的实验室使用非衍生法进行筛查，且使用非衍生法进行筛查的实验室切值主要来源于试剂厂家说明书，而使用衍生法的24家实验室切值主要由实验室自己确定或来源于参考文献。从切值百分位数分布结果看，第25位百分数与第75位百分数接近，但部分项目实验室间差异较大。

氨基酸和酰基肉碱的切值是用于评价新生儿是否患有遗传代谢病的指标，而不恰当的切值可能导致假阴性或者假阳性，造成临床判读的偏差，国家卫生健康委临床检验中心2017年EQA计划临床判断值的调查结果显示，实验室的临床判断值出现较大差异，35%的实验室氨基酸和酰基肉碱临床判断值与预期结果不一致。分析原因发现，除其中32%的实验室检测浓度存在系统误差外，68%的实验室是由于切值设置不合理造成的。根据美国临床生物化学研究院实验室操作指南建议的串联质谱新生儿遗传代谢病筛查实验室应筛选几百份甚至上千份正常新生儿样本，且筛选样本新生儿的年龄应与实验室实际筛查年龄一致，通过计算检测结果的P1、P10、P99、P99位数，初步确定切值，高值为P99位数，低值为P10，再用1 000份新生儿样本进行验证，当阳性病例累积到一定数量时，高值可以选择正常结果的99%位数到阳性结果的5%位数区间，低值可以选择阳性结果的P99到正常结果的P1区间，实验室确定切值需定期调整并验证[5]。当然，切值设定的合理性还与室内质量控制息息相关，一般氨基酸类检测项目变异系数在10%以内，肉碱类检测项目变异系数在40%以内，只有稳定的检测结果切值才具有临床意义。

串联质谱新生儿遗传代谢病筛查不同于其他生化检测，可1次检测出数十种氨基酸及酰基肉碱，计算时再加入几十个氨基酸或酰基肉碱之间的比值，最终由计算机软件得出的结果可达100余项，并且1个指标可指向多种疾病，多个指标也可指向1种疾病，这就需要根据不同疾病的发病机制所导致的血中特异性氨基酸或酰基肉碱的异常进行分析，规则和切值设定，一直是困扰临床的难点[5-6]。同时，串联质谱检测多种氨基酸和酰基肉碱的影响因素较多，如血斑的基质效应、内标物的稳定性、样本的前处理过程等。此外，我国筛查实验室区域性发展不平衡，浙江、上海、北京、广州地区新生儿筛查中心串联质谱筛查量大（＞3万），其中浙江省儿童医院年筛查量达40万，而更多的实验室才刚刚起步，年串联质谱筛查量不足1万[3]。另外，除苯丙酮尿症外，其他遗传代谢病发病率低，导致不少实验室因阳性样本不足而切值设置不合理。2005年，美国梅奥诊所开发了美国区域性串联质谱新生儿疾病筛查实验室质量改进项目（Region 4 Stork，R4S），迄今为止已发展成为包含67个国家270个项目组的合作项目。R4S系统作为大样本数据平台，提供多种分析工具用于77种遗传代谢病的筛查和诊断，该系统可以优化临床特异性指标，评估现用切值，帮助实验室提高阳性预测值[7]。浙江省儿童医院回顾性分析了实验室30多万个筛查数据，并通过参与R4S计划评估实验室切值，从而提高了实验室的阳性预测值。而美国R4S新生儿筛查数据库的数据大都来源于非亚洲国家，是否完全适合我国新生儿筛查，能否作为金标准，是需要探讨的问题。

总之，目前我国新生儿遗传代谢病筛查串联质谱切值差异较大，需要实验室进行评估和验证。国家卫生健康委临床检验中心将在国家重点专项基金的支持下联合全国新生儿筛查中心及浙江大学计算机科学与技术学院开发中国新生儿遗传代谢病筛查串联质谱切值评价平台，进一步有效评价新筛实验室切值。