芹菜素对H2O2诱导人肝细胞L02氧化损伤模型的影响

杜毅超， 张 浩， 黄治伟， 浦仕林， 钱保林， 赖 莉， 谭 鹏，夏先明， 付文广

西南医科大学附属医院 a.四川省院士(专家)工作站; b.肝胆外科， 四川 泸州 646000

Effect of apigenin on H2O2-induced oxidative injury in human hepatocytes L02

DUYichao,ZHANGHao,HUANGZhiwei,etal.(Academician

(Expert)WorkstationofSichuanProvince,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of apigenin against H2O2-induced injury in human hepatocytes (L02).MethodsL02 cells were treated with H2O2 to establish a model of oxidative injury. CCK-8 assay was used to measure cell viability; DCFH-DA was used to measure the production of reactive oxygen species (ROS) in cells; test kits were used to measure the activities of lactate dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA), and superoxide dismutase (SOD) in cell supernatant; Hoechst staining was performed to observe cell apoptosis, and a test kit was used to observe the activity of caspase-3. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the LSD-ttest was used for further comparison between two groups.ResultsApigenin at a concentration of ≥20 μmol/L significantly inhibited the proliferation of L02 cells (P<0.01). Compared with the cells in the blank control group, the cells treated with H2O2at a concentration of ≥500 μmol/L had a significant reduction in cell viability (P<0.001), and therefore, 500 μmol/L was determined as the optimal concentration for modeling. There was a significant difference in cell viability between the model group and the blank control group (P<0.01), and compared with the model group, the 5 and 10 μmol/L apigenin groups had a significant increase in cell viability (P<0.01). The cells in the blank control group had good morphology, while those in the model group were contracted and round-shaped and had marked rupture and deformity, and compared with the model group, the 5 μmol/L apigenin group showed significant improvement with a reduction in ruptured and round-shaped cells. There was a significant difference in fluorescence intensity between the blank control group, the model group, and the 5 μmol/L apigenin group (1.00±0.26 vs 32.94±1.29 vs 13.49±1.23,F=1.10,P<0.001), and the model group had a significantly higher fluorescence intensity than the blank control group (P<0.001). Compared with the model group, the 5 μmol/L apigenin group had a significant reduction in H2O2-induced ROS (P<0.001). Compared with the control group, the model group had significant increases in the levels of LDH and MDA and a significant reduction in the level of SOD (F=3.21, 2.03, and 3.32, allP<0.05), and compared with the model group, the 5 μmol/L apigenin group had significant reductions in the levels of LDH and MDA and a significant increase in the level of SOD (allP<0.05). There was a significant difference in cell apoptosis rate between the blank control group, the model group, and the 5 μmol/L apigenin group (7.54%±0.52% vs 39.77%±3.44% vs 14.40%±0.79%,F=9.439,P<0.01], and the model group had a significantly higher cell apoptosis rate than the control group (P<0.01); the cells treated with apigenin had a significantly lower apoptosis rate than those in the model group (P<0.01). There was a significant difference in the activity of caspase-3 between the blank control group, the model group, and the 5 μmol/L apigenin group (4.38±0.59 U/mg vs 16.44±1.13 U/mg vs 10.60±1.04 U/mg,F=1.17,P<0.05), and the model group had a significantly higher activity of caspase-3 than the blank control group (P<0.05); compared with the cells in the model group, the cells treated with apigenin had a significant reduction in the activity of caspase-3 (P<0.05).ConclusionApigenin may exert a protective effect against H2O2-induced injury in L02 cells by eliminating ROS and reducing caspase-3 activity.

Keywords：apigenin； hydrogen peroxide； LO2 cells； oxidative damage; apoptosis

氧化应激在非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化等肝病的发生发展中起重要作用[1]。正常条件下，细胞通过特殊的机制维持氧化物与抗氧化物之间的平衡，而活性氧(ROS)过量会引发氧化应激，破坏肝细胞的蛋白、脂质及DNA，进而影响细胞结构，导致肝脏的结构及功能发生异常[2]。近年来，人们从中草药中分离提纯的一些天然活性物质能够通过改变氧化应激发挥保肝护肝脏的作用[3-4]。芹菜素(Apigenin)是日常饮食中含有的一种黄酮类化合物，主要存在于芹菜、欧芹、洋甘菊等植物中[5]。研究[6-8]表明芹菜素具有很多生物活性，如抗氧化、抗癌、抗炎等多种作用。本研究利用H2O2刺激L02细胞构建体外氧化应激损伤模型，观测芹菜素对氧化应激及ROS生成的影响，探讨芹菜素的抗氧化、抗凋亡作用，为其作为潜在的保肝护肝药物成分提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肝细胞L02购自上海中国科学院细胞库；芹菜素(纯度≥98%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高糖DMEM培养基、青链霉素、0.25%胰酶均购自美国HyClone公司；胎牛血清购自上海中乔新舟生物科技有限公司；CCK-8购自上海东仁化学科技有限公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒、caspase-3 活性检测试剂盒及活性氧检测探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)均购自上海碧云天生物技术有限公司；LDH、MDA、SOD检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。高速冷冻离心机、全光谱分光光度计、细胞培养箱均购自美国ThermoFisher Scientific公司；生物安全柜购自新加坡ESCO公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将L02细胞以10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。

1.2.2 芹菜素对L02细胞活力的影响 取对数期L02细胞调整浓度至6×104个/ml，每孔100 μl接种于96孔板，接种12 h后，细胞完全贴壁，分别用含1、2.5、5、10、20、40 μmol/L芹菜素的培养基替换原有培养基，并设置空白对照孔，每个浓度做6个复孔。在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养12 h后,CCK-8检测各组细胞在450 nm波长处的光密度(OD)值，并计算细胞活力。

1.2.3 H2O2诱导L02细胞氧化损伤模型的建立 取对数期L02细胞调整浓度至6×104个/ml，每孔100 μl接种于96孔板，接种12 h后细胞完全贴壁，分别加入100、300、500和700 μmol/L的H2O2培养4 h后CCK-8检测各组细胞在450 nm波长处的OD值，并计算细胞活力。确定H2O2的最佳浓度。

1.2.4 芹菜素对H2O2损伤L02细胞活力的影响 取对数期L02细胞调整浓度至6×104个/ml，每孔100 μl接种于96孔板，接种12 h后细胞完全贴壁，实验分为6组，分别为对照组、模型组(H2O2，500 μmol/L)和4个芹菜素实验组(1、2.5、5和10 μmol/L)。芹菜素预处理4 h后，加H2O2处理4 h，通过CCK-8检测各组细胞在450 nm波长处的OD值，并计算细胞活力。

1.2.5 ROS含量的测定 取对数期L02细胞接种于24孔板，接种12 h后细胞完全贴壁，实验分为3组，分别为对照组、模型组(H2O2，500 μmol/L)和芹菜素(5 μmol/L)组。芹菜素预处理4 h后，加H2O2处理4 h，严格按照活性氧检测试剂盒说明书进行操作，荧光显微镜下观察拍照，并记录各组细胞的荧光强度，以对照组计算相对荧光强度。

1.2.6 细胞上清液体中丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的检测 取对数期L02细胞接种于24孔板，分组、给药及造模同1.2.5节，造模4 h后收集细胞培养上清，严格按照试剂盒说明书进行操作，检测细胞培养上清中MDA含量、LDH及SOD活性。

1.2.7 Hoechst凋亡染色 取对数期L02细胞接种于24孔板，分组、给药及造模同1.2.5节，造模4 h后用4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS轻轻润洗3次，加入Hoechst 33342 0.5 ml，染色10 min后PBS轻轻润洗3次，每次5min，荧光显微镜下观察拍照，并计算各组细胞凋亡率。

1.2.8 caspase-3活性测定 取对数期L02细胞接种于6孔板，分组、给药及造模同1.2.5节，造模4 h后收集细胞，严格按照试剂盒说明书进行操作，检测各组细胞caspase-3活性。

2 结果

2.1 不同浓度芹菜素对L02细胞活力的影响 为优化芹菜素浓度，采用1、2.5、5、10、20和40 μmol/L 6个浓度分析L02细胞活力。结果显示，芹菜素浓度为≥20 μmol/L时对L02细胞的增殖有显著抑制作用(P值均<0.01)(图1)。

注: 与对照组比较，*P<0.01。

2.2 H2O2诱导L02细胞损伤模型的建立 为筛选出合适的H2O2建模浓度，用不同浓度的H2O2刺激L02细胞4 h。结果显示，随着H2O2浓度的增加，细胞活力也明显受到抑制，与空白对照组L02细胞活力相比，500 μmol/L及以上的H2O2浓度均可使细胞活力显著降低(P<0.001)(图2)。因此，后续实验选择500 μmol/L作为H2O2的建模浓度。

2.3 芹菜素对H2O2损伤L02细胞活力的影响 CCK-8测定结果显示，模型组细胞活力与空白对照组相比差异显著(P<0.01)；与模型组相比，芹菜素5、10 μmol/L 组细胞存活率显著提高(P值均<0.01)(图3)。

注: 与对照组比较，*P<0.01，**P<0.001。

注：与空对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，

2.4 芹菜素对H2O2损伤L02细胞形态的影响 空白对照组细胞状态较好，细胞延展良好，贴壁牢固，细胞间融合度较高；模型组细胞间收缩变圆，有细胞脱落，细胞破损变形严重；而芹菜素 5 μmol/L组与模型组相比，明显得到改善，变圆破损细胞较少(图4)。

注：a，对照组；b，模型组；c，芹菜素5 μmol/L组。

图4芹菜素对H2O2诱导的L02细胞形态的影响

2.5 芹菜素对H2O2损伤L02细胞ROS水平的影响 空白对照组、模型组、芹菜素5 μmol/L组3组间相对荧光强度比较差异有统计学意义(1.00±0.26 vs 32.94±1.29 vs 13.49±1.23,F=1.10，P<0.001)；模型组相对荧光强度较空白对照组明显增强(P<0.001)，表明模型组产生大量的ROS；而芹菜素5 μmol/L组与模型组比较，芹菜素可明显清除H2O2诱发的ROS(P<0.001)(图5)。

注：a，对照组；b，模型组；c，芹菜素 5 μmol/L组。

图5芹菜素对H2O2诱导的L02细胞中ROS的影响

2.6 芹菜素对H2O2损伤L02细胞上清中LDH、MDA、SOD的影响 如表2所示，模型组中LDH和MDA水平均明显升高，SOD水平明显降低，与空白对照组相比差异均有统计学意义(P值均<0.001)；经过芹菜素(5 μmol/L)处理后，与模型组相比，LDH和MDA水平均明显降低，SOD水平明显升高(P值均<0.05)。以上结果提示，芹菜素能够抑制H2O2对L02细胞的氧化损伤。

表1 芹菜素对H2O2损伤L02细胞上清中LDH、MDA、SOD的影响

注：与对照组相比，1)P<0.001；与模型组相比，2)P<0.05。

2.7 Hoechst凋亡染色观测L02细胞凋亡情况 采用Hoechst 33342 染核后，凋亡细胞核会在荧光显微镜下发出强蓝色荧光。空白对照组出现强蓝色荧光细胞核的细胞数量极少，模型组有较多细胞出现强蓝色荧光细胞核，而用芹菜素(5 μmol/L)处理后强蓝色荧光细胞核明显减少(图6)。

注：a，对照组；b，模型组；c，芹菜素 5 μmol/L 组。

图6芹菜素对H2O2诱导的L02细胞凋亡的影响

空白对照组、模型组、芹菜素5 μmol/L组3组间细胞凋亡率比较差异有统计学意义7.54%±0.52% vs 39.77%±3.44% vs 14.40%±0.79%，F=9.44,P<0.01);模型组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01);给予芹菜素处理后，相比于模型组凋亡率明显降低(P<0.01)。说明芹菜素可抑制细胞凋亡。

2.8 芹菜素对H2O2损伤L02细胞caspase-3活性的影响 空白对照组、模型组、芹菜素5 μmol/L组3组间caspase-3活性比较差异有统计学意义[(4.38±0.59) U/mg vs (16.44±1.13) U/mg vs (10.60±1.04) U/mg,F=1.17，P<0.05];模型组细胞caspase-3活性与对照组相比明显增强(P<0.05);给予芹菜素(5 μmol/L)处理后，相比于模型组caspase-3活性明显降低(P<0.05)。提示芹菜素可以通过调节caspase-3活性来抑制细胞的凋亡。

3 讨论

SOD酶系是最早发现具有抗氧化作用的酶防御系统之一，其活性反映细胞抗氧化能力[11]。MDA是脂质过氧化物中最具诱变作用的产物，其含量反映细胞氧化损伤的程度[12]。芹菜素具有很强的抗氧化作用，Zare等[13]通过阿霉素诱导的心脏毒性发现，芹菜素可明显提高大鼠SOD水平并降低MDA水平，从而减轻心肌损伤。Huang等[14]研究发现芹菜素预处理可通过Notch1/Hes1介导的线粒体途径减轻心肌缺血再灌注损伤，提高SOD活性并对MDA产生起抑制作用，从而增强心肌细胞的抗氧化能力。Sang等[15]研究表明芹菜素可通过激活Nrf2在d-半乳糖诱导的衰老小鼠模型中显示保护作用，芹菜素降低了MDA水平，并提高了SOD和过氧化氢酶活性，表现出有效的抗氧化活性。为了解天然活性物质芹菜素对肝细胞损伤的作用效应，本研究通过H2O2建立L02细胞氧化损伤模型，通过一系列实验，发现芹菜素可减弱H2O2致人肝细胞L02生长抑制，增强SOD活性，降低MDA的生成，提高细胞对ROS的清除能力。

Caspase-3是凋亡过程中起核心作用的关键酶，是凋亡的主要执行者，负责100多种不同底物的蛋白水解，最终导致细胞解体和凋亡[16-18]。Duarte等[19]研究发现芹菜素可通过减少caspase-3激活和调节线粒体功能来保护内皮细胞免于脂多糖诱导的炎症。本研究通过Hoechst凋亡染色及测定细胞内caspase-3活性发现经过芹菜素的干预后，凋亡细胞明显减少，caspase-3活性明显降低，表明芹菜素可抑制人肝细胞L02的凋亡。

基于以上的论述，本研究旨在利用H2O2诱导L02细胞氧化损伤模型观察芹菜素的抗氧化损伤能力。结果表明芹菜素对人肝细胞L02氧化损伤具有保护作用，可能是通过提高人肝细胞L02中抗氧化酶的活性，降低过氧化物的产生，提高清除自由基能力来减轻细胞氧化损伤；此外芹菜素还可通过降低人肝细胞L02的caspase-3活性来抑制细胞凋亡。本实验为芹菜素的进一步研发应用提供了更多的基础研究支持。