绿僵菌MaFZ-13对油桐鹰尺蠖致病力的时间-剂量-死亡率模型分析

蔡守平

(福建省林业科学研究院，福建省森林培育与林产品加工利用重点实验室，福建福州 350012)

油桐鹰尺蠖Biston suppressaria(Guenée)(Lepidoptera:Geometridae)[1]，异名:Buzura suppressaria(Guenée)，又称油桐尺蠖、桉尺蠖等，分布广泛，食性杂，可危害桉树、油桐、茶树、核桃、木荷等数十种木本植物[2]。近年来在速生桉树上大面积暴发，甚至数千亩连片发生，可将整片林分的叶片全部吃光，形如枯死，严重影响林木的健康生长，造成较大的经济损失[3-4]。目前，油桐鹰尺蠖主要依靠化学农药进行防治，但大量使用化学农药可能带来环境污染等问题[5]，因此，探寻高效、环保的生物防治资源是生产上的迫切需求。

绿僵菌Metarhizium是应用广泛的杀虫真菌，筛选对靶标害虫具有较强致病力的优良菌株是绿僵菌应用的基础[6-7]，已有学者筛选出对鞘翅目[8-11]、鳞翅目[12-14]、半翅目[15]及膜翅目[16]等多种害虫具有较高致病力的优良菌株。蔡守平等筛选出1株对油桐鹰尺蠖幼虫具有较强致病力的金龟子绿僵菌M.anisopliae菌株MaFZ-13[17]，笔者利用时间-剂量-死亡率模型(TDM模型)，分析该菌株对油桐鹰尺蠖幼虫的致病力，为进一步开发应用该菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 金龟子绿僵菌MaFZ-13，原始寄主为鳞翅目幼虫，由本课题组人员分离，保存于福建省林业科学研究院森林保护研究所。将菌株接种于PDA平板培养基上，在(25±1)℃的恒温培养箱中培养15 d，获得分生孢子用于生物测定。

1.2 试虫 2019年5月中旬，在福建省漳浦县长桥镇潭阳村2 a生桉树林中采集油桐鹰尺蠖，以3～4龄幼虫为主，尼龙养虫笼中以新鲜桉树叶饲养。

1.3 孢子悬浮液配制 从产孢好的平板培养基表面获得分生孢子[18]，用0.03%吐温-80溶液分别配制成 1.0 × 109，1.0×108，1.0 × 107，1.0 × 106，1.0×105孢子/mL的孢子悬浮液，用于接种试验。

1.4 生物测定 挑选健康的油桐鹰尺蠖幼虫放置于昆虫饲养盒中，每盒20头，为1个重复，每个浓度处理3个重复。使用微量喷雾法将孢子悬浮液均匀喷在试虫的体表，每重复2 mL，对照以灭过菌的0.03%吐温-80溶液处理。处理后将养虫盒置于室内自然室温下，温度变幅为22～30℃，养虫盒内使用无菌水润湿的棉球保湿。每2 d更换1次新鲜桉树叶，每天记录幼虫存活情况，统计死亡率。

1.5 数据处理 试验数据用DPS数据处理软件(v7.05版本)分析处理，用软件自带的时间-剂量-死亡率模型分析功能对生测数据分析，得到绿僵菌对油桐鹰尺蠖幼虫致病力的TDM模型模拟与参数估计，进而分析时间效应和剂量效应[19-21]。

2 结果与分析

2.1 绿僵菌MaFZ-13孢子对油桐鹰尺蠖幼虫的致病力 油桐鹰尺蠖幼虫接种绿僵菌MaFZ-13不同浓度孢子悬浮液均可出现死亡，但累计死亡率和死亡速度差异较大，累计死亡率随着孢子悬浮液浓度的增大和接种时间的延长而增加(图1)。

图1 绿僵菌MaFZ-13孢子对油桐鹰尺蠖幼虫致病力Fig.1 Cumulative mortality of B.suppressaria larvae inoculated M.anisopliae MaFZ-13 conidia

接种1.0×109，1.0×108孢子/mL悬浮液的幼虫死亡速度差异不大，死亡高峰期出现在3～7 d，接种7 d后，幼虫累计死亡率均超过80%；10 d分别达到100%和98.3%。1.0×107孢子/mL处理的幼虫死亡高峰出现在3～8 d；接种10 d后，累计死亡率为91.7%。而接种1.0×106，1.0×105孢子/mL悬浮液的幼虫死亡速度较慢，累计死亡率也较低；接种10 d后，幼虫累计死亡率分别为70%和48.3%；15 d时，累计死亡率为76.7%和56.7%。对照组15 d时死亡率为8.3%。处理组虫尸经保湿培养后，大部分表现出感病症状。

2.2 时间-剂量-死亡率模型分析 通过时间-剂量-死亡率(TDM模型)模型对试验数据进行建模分析，结果见表1。模型中γ值反映在接种后第j个时段里油桐鹰尺蠖幼虫的平均死亡率。条件死亡率模型中各处理剂量与时间效应参数的t测验值均达到极显著水平，说明时间、剂量及其二者之间的互作效应对油桐鹰尺蠖幼虫的死亡率均有显著贡献。

绿僵菌对油桐鹰尺蠖幼虫的剂量效应参数β为0.422 7，卡方统计量为0.874 9(df＝8，P＝0.998 9)，小于，表明利用生测数据建立的模型通过了Hosemr-Lemeshow拟合异质性检验[13]，即分析结果描述绿僵菌不同浓度与油桐鹰尺蠖幼虫间的互作关系。幼虫接种后3～8 d，γi值较前后变化较大，表明该时间段幼虫死亡数较多。累计死亡率效应参数τ值反映在第j个时段里幼虫的累计死亡率，τ值一直随时间推移而增大，说明累计死亡率随着时间增大。

表1 绿僵菌MaFZ-13对油桐鹰尺蠖幼虫的TDM模型模拟与参数估计Tab.1 Parameters estimated from modeling of the time-dose-mortality using bioassay for M.anisopliae MaFZ-13 against B.suppressaria larvae

2.3 绿僵菌MaFZ-13对油桐鹰尺蠖幼虫的剂量效应和时间效应 绿僵菌对油桐鹰尺蠖幼虫的致死浓度(LC50和 LC90)随时间延长而降低，绿僵菌MaFZ-13菌株接种油桐鹰尺蠖幼虫第4，5，6，7天的致死中浓度(LC50)对数值分别为7.79，6.97，6.33，5.64。接种后3 d以内幼虫死亡率较低，所以估算出的LC50和LC90偏大(图2)。

图2 绿僵菌MaFZ-13对油桐鹰尺蠖幼虫的致死剂量估计Fig.2 Logarithms of the time-dependent LC50and LC90values for M.anisopliae against B.suppressaria larvae

孢子悬浮液浓度越高，绿僵菌MaFZ-13对油桐鹰尺蠖幼虫致病力的致死时间LT50和LT90值越小，接种 1.0 ×107，1.0 ×108，1.0×109孢子/mL 浓度的 LT50值分别为 4.96，3.79，2.89 d，而 LT90值分别为11.58，7.76，6.29 d(表2)。

表2 绿僵菌MaFZ-13孢子对油桐鹰尺蠖的致死时间估计值Tab.2 The estimated value of LT50和LT90of M.anisopliae against B.suppressaria larvae

3 结论与讨论

油桐鹰尺蠖幼虫的累计死亡率随接种绿僵菌MaFZ-13孢子悬浮液浓度增大和接种时间延长而增加，绿僵菌对害虫致死过程中的剂量效应和时间效应存在显著的互作关系。通过时间-剂量-死亡率模型(TDM模型)分析结果描述不同浓度绿僵菌与油桐鹰尺蠖幼虫间的互作关系，致死时间随着孢子悬液浓度的增加而缩短，当孢子浓度为1.0×107，1.0 ×108，1.0 ×109孢子/mL 时，致死中时(LT50)值分别为 4.96，3.79，2.89 d。 可见，绿僵菌MaFZ-13是1株对油桐鹰尺蠖幼虫具有较强致病力的菌株，具有较好的应用潜力，107～108孢子/mL是较理想的防治油桐鹰尺蠖幼虫施用浓度。试验结果为科学利用该菌株进行油桐鹰尺蠖的生物防治提供了科学依据。但林间环境复杂，与实验室试验条件有较大差别，尤其是桉树属速生树种，树体通常高大，而油桐鹰尺蠖幼虫一般在林冠层危害，如何科学施菌对能否取得良好防治效果十分关键，故林间应用技术需进一步研究。

受试虫、工作量等因素的影响，在比较多个菌株对害虫致病力时，往往仅分析了不同菌株的时间效应，即以某个特定的浓度进行接种，将受试昆虫在生测期间的累计死亡率进行机率值转换后，通过建立直线回归模型，估计致死时间(LT50，LT90)[8-16]。时间-剂量-死亡率(TDM)模型则使用同一个模型同时分析时间与剂量效应，避免了时间效应和剂量效应的相互排斥[19-20]，体现了时间和剂量间的互作，充分体现实验数据的完整性，应用该模型来分析评价菌株的生防潜力更加全面可靠[22-23]。