补肾壮筋汤介导内质网应激延缓毒胡萝卜素诱导大鼠椎间盘软骨细胞的退变

2020-06-12 11:41梅阳阳林伟
风湿病与关节炎 2020年5期

梅阳阳 林伟

【摘 要】目的:观察补肾壮筋汤(BZD)对毒胡萝卜素(TG)诱导大鼠椎间盘软骨细胞内质网应激反应的影响。方法:①RT-PCR法检测经TG(2 μmol·L-1)诱导大鼠椎间盘软骨细胞中蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子(Eif2α)、激活转录因子4(ATF4)、生长阻滞和DNA损伤诱导基因153(GADD153)mRNA表达;②Western Blot法检测经TG诱导大鼠椎间盘软骨细胞PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白含量表达。结果:①RT-PCR结果显示,与模型对照组比较,补肾壮筋汤200,400,600 μg·mL-1组的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153mRNA含量表达均呈降低趋势;②Western Blot结果显示,与模型对照组比较,补肾壮筋汤200,400,600 μg·mL-1组的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白含量表达显著降低,尤其400 μg·mL-1组降低更显著(P < 0.01)。结论:补肾壮筋汤可通过下调TG诱导大鼠椎间盘软骨细胞中与内质网应激反应相关的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA与蛋白含量表达,进而延缓大鼠椎间盘软骨细胞退变。

【关键词】 椎间盘软骨退变;补肾壮筋汤;内质网应激;毒胡萝卜素;大鼠

【ABSTRACT】Objective:To observe the effect of Bushen Zhuangjin Tang(补肾壮筋汤,BZT)on the endoplasmic reticulum stress in rats with intervertebral disc chondrocytes induced by thapsigargin.Methods:①RT-PCR was used to detect the expressions of PERK,Eif2α,ATF4 and GADD153 mRNA in rats with intervertebral disc chondrocytes induced by thapsigargin(2 μmol·L-1).②Western Blot was used to detect the protein expressions of PERK,Eif2α,ATF4 and GADD153.Results:①RT-PCR showed that compared with the model control group,the expressions of PERK,Eif2α,ATF4 and GADD153 mRNA in the groups of BZT 200,400,600 μg·mL-1 decreased;②Western Blot showed that compared with the model control group,the protein expressions of PERK,Eif2α,ATF4 and GADD153 in above three groups significantly decreased,especially in the group of BZT 400 μg·mL-1(P < 0.01).Conclusion:BZT can delay the degeneration of chondrocytes by way of down regulating PERK,Eif2α,ATF4 and GADD153 mRNA and protein expression.

【Keywords】 intervertebral disc chondrocytes;Bushen Zhuangjin Tang(補肾壮筋汤);endoplasmic reticulum stress;thapsigargin;rats

脊柱椎间盘发生渐进性退变是引起脊柱退行性疾病(腰、颈椎退行性病变)的关键因素,而椎间盘退变的重要病理事件在于椎间盘软骨细胞因生物因素及力学异常改变,致使软骨终板(椎间盘软骨细胞)合成代谢功能偶联失衡,导致椎间盘微环境、脊柱各关节及脊柱间组织的形态与功能受损,最终诱发脊柱关节炎的发生[1-3]。而脊柱椎间盘关节软骨退变引起的骨关节炎属中医学“骨痹”范畴,其主要病因为“本痿标痹”“本虚标实”,故对其治疗宜补益肝肾、祛风除湿[4]。

补肾壮筋汤源于清代《伤科补要》,具有补益肝肾、强筋壮骨的作用,切合骨痹的治则[5]。临床研究显示,补肾壮筋汤可有效改善脊柱关节病的临床症状,延缓疾病进展[6-7]。

内质网应激介导脊柱骨关节炎软骨退变,相关研究发现,内质网应激介导的细胞凋亡途径可直接损伤软骨细胞和基质成分,从而参与骨关节炎的病理过程[8]。其中蛋白激酶样内质网激酶(PERK)作为活跃在内质网中的Ⅱ型跨膜蛋白,可通过二聚化和磷酸化转变为活化型PERK,进而参与真核翻译起始因子(Eif2α)的磷酸化过程,进而引起GTP-GDP转化障碍,从而阻止蛋白合成[9];随着Eif2α的磷酸化,可使激活转录因子4(ATF4)水平表达升高,而后者可促进生长阻滞和DNA损伤诱导基因153(GADD153)的表达,进而引起钙离子通道活化,引起Caspase-12激活,并激活下游的效应组Caspase,最终导致软骨细胞的凋亡[10-11]。

因此,本实验通过观察补肾壮筋汤对毒胡萝卜素(TG)诱导大鼠椎间盘软骨细胞内质网应激反应的影响,初步探讨与阐释其延缓大鼠椎间盘软骨细胞退变的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 4周龄SD雄性大鼠(SPF级)

18只,由福建中医药大学实验动物中心提供,实验动物许可证号SCXK2014-0001(闽),体质量90 g。

1.2 主要试剂 补肾壮筋汤组方药材(熟地黄12 g、

山茱萸12 g、杜仲10 g、续断12 g、五加皮10 g、当归12 g、白芍10 g、茯苓12 g、青皮5 g、牛膝10 g)购于福建中医药大学附属第三人民医院;逆转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司);琼脂糖(Biowest Agarose);核酸染料(Solarbio);DMEM/LOW GLUCOSE(HyClone);磷酸盐缓冲液(HyClone);TRIZOL(美国Life公司);PERK、Eif2α、ATF4、GADD153、β-actin引物(上海生工);一抗(兔抗),PERK(bs-2469R)、Eif2α(bs-3613R)、ATF4(bs-1531R)、GADD 153(bs-8875R,北京博奥森生物技术有限公司);β-actin(ab179467,Abcam);二抗(羊抗兔)(美国CST公司);1-StepTM Transfer Buffer(批号PA196400,Thermo);ECL高效显影液(Thermo)等。

1.3 主要仪器 离心机(高速低温型,美国BECKMAN);超净工作台(SW-CJ-1F型,苏州安泰);凝胶成像系统(GELDOC2000型,美国BIO-RAD);CO2恒温培养箱(BB16/BB5060型,德国Heraus);DNA扩增仪(9600型,美国PE);荧光倒置相差显微镜(Olympus,日本TKO);全自动酶标仪(BIO-TEK ELX800型,美国BIO-Tek)等。

2 方 法

2.1 补肾壮筋汤水提物的制备 精确称取熟地黄12 g、山茱萸12 g、杜仲10 g、续断12 g、五加皮10 g、当归12 g、白芍10 g、茯苓12 g、青皮5 g、牛膝10 g,水回流提取2次,每次2 h,合并提取液,抽滤,浓缩成浸膏,60 ℃水浴蒸干至恒重;待经低温下研磨成粉末状,精确称量浸膏50 mg,加入体积分数为5%的FBS培养基5 mL溶解,超声10 min,再经0.22 μL无菌滤嘴滤过后放入4 ℃冰箱保存备用,配成10 mg·mL-1补肾壮筋汤水提物母液,備用[12]。

2.2 软骨细胞的分离、培养 4周龄SD大鼠直接经戊巴比妥钠(质量浓度2%,按40 mg·kg-1腹腔膜注射)麻醉后行脱颈椎处死,分离并收集大鼠颈、腰椎椎间盘软骨终板组织,修剪至每单位体积1 mm3,PBS轻柔漂洗后倒净,使用移液枪加入

Ⅱ型胶原酶(质量浓度0.2%)进行初次消化,收集上清液至15 mL离心管中,经离心后弃上清液保留软骨细胞沉淀团块,吸取DMEM(含体积分数为10%的胎牛血清),重悬吹匀沉淀,软骨细胞经精确计数(2×105个·mL-1)后移种至培养瓶中进行孵育培养[4]。

2.3 实验分组 在六孔板各孔中央部接种含有

二代软骨细胞的重悬液(1×105个·mL-1),待软骨细胞爬片孵育后,标记分为5组:空白对照组,模型对照组,补肾壮筋汤水提物200,400,600 μg·mL-1组。①空白对照组:使用移液枪添加2 mL体积/单孔的软骨细胞培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM),4 h后再换新的正常培养基继续作用48 h。②模型对照组:参照课题组前期研究[13],即每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培养基2 mL,干预4 h后再换为正常培养基继续作用48 h。③补肾壮筋汤水提物200 μg·mL-1组:先向每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培养基2 mL,4 h后再换为含200 μg·mL-1补肾壮筋汤水提物的培养基继续作用48 h。④补肾壮筋汤水提物400 μg·mL-1组:先向每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培养基2 mL,4 h后再换为含400 μg·mL-1补肾壮筋汤水提物的培养基继续作用48 h。⑤补肾壮筋汤水提物600 μg·mL-1组:先向每孔加入含2 μmol·L-1 TG的正常培养基2 mL,4 h后再换为含600 μg·mL-1补肾壮筋汤水提物的培养基继续作用48 h[14]。

2.4 RT-PCR法检测PERK、Eif2α、ATF4、GADD153mRNA表达 PCR条件为94 ℃ 4 min条件下首先进行预变性,循环35次(94 ℃ 30 s、退火58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s),后置于72 ℃ 10 min,并于4 ℃保存;制备质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶,上样后,在100 V、70 mA、15 min条件下电泳,使用BIO-RAD Fluor-S TM MultiImager图象分析仪下扫描,经分析后拍照存档。RT-PCR实验相关基因的引物序列见表1。

2.5 Western Blot法检测大鼠椎间盘软骨细胞PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白表达 提取各组大鼠椎间盘软骨细胞总蛋白,BCA进行蛋白定量,配制体积分数为12%的分离胶和体积分数为5%的浓缩胶;上样后进行电泳,采用半干式进行转膜,脱脂牛奶封闭2 h后洗膜;再将各条膜放入预先配置好的β-actin(1∶1000)、PERK、Eif2α、ATF4、GADD153(1∶1000)的一抗中4 ℃冰箱摇床震荡过夜,漂洗3遍(每遍10 min)后置于二抗(1∶5000)封闭袋中室温反应1 h;再漂洗3遍(每遍10 min),最后配制ECL发光液进行显影,在凝胶成像仪下曝光成像并分析储存。

2.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示,2组间比较采用t检验与单因素方差分析;计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 RT-PCR检测结果 RT-PCR检测结果如图1、图2所示,补肾壮筋汤水提物200,400,600 μg·mL-1作用于经TG诱导退变的大鼠椎间盘软骨细胞后,可下调PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA含量表达。与空白对照组比较,模型对照组PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA含量均显著升高,差异有统计学意义(P < 0.01),提示大鼠椎间盘软骨细胞在一定程度上发生退变;在PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA指标上,与模型对照组比较,补肾壮筋汤水提物200,400,600 μg·mL-1组的mRNA含量均降低,尤其400 μg·mL-1组降低更显著(P < 0.01),提示补肾壮筋汤水提物可通过调控PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA表达延缓大鼠椎间盘软骨细胞的退变进程。

3.2 PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白表达检测结果 Western Blot结果如图3、图4所示,在PERK、Eif2α、ATF4、GADD153指标上,与模型对照组比较,补肾壮筋汤水提物200,400,600 μg·mL-1组的蛋白含量均降低,尤其以400 μg·mL-1组的表达量最低(P < 0.01),提示狗脊多糖在一定程度上通过调控PERK、Eif2α、ATF4、GADD153蛋白表达,发挥延缓软骨细胞退变作用。

4 讨 论

内质网应激途径参与调控软骨退变的病理进程。内质网应激是独立于Fas途径和一氧化氮途径的细胞凋亡途径。研究证实,内质网应激影响软骨细胞的分化,同时抑制软骨细胞的合成功能,细胞可调动应激反应蛋白减轻应激因素对细胞的损伤,使内质网适应新的内环境要求;同时细胞表达的内质网应激蛋白如GADD153、Caspase-12等,可启动细胞凋亡来处理不能修复的损伤细胞,减轻应激对细胞的损害。但过度的内质网应激反应可以导致软骨细胞凋亡,在骨关节炎患者的软骨细胞中存在内质网应激,随着病情的发展,内质网过载,会通过GADD153的高表达诱导软骨细胞的凋亡[15-17]。

椎间盘关节软骨退变属中医学“骨痹”范畴,基于陈可冀院士学术思想认识,其主要病理表现为“软骨退行性病变的同时伴有新骨形成”,故对其治疗的根本法则为补益肝肾、祛风除湿[18],补肾壮筋汤具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血功效,本方以熟地黄、山茱萸为君药,补肝益肾、填精补髓;续断、杜断、五加皮协助君药补益肝肾、强筋壮骨,并兼祛风除湿;佐以当归活血补血,白芍敛阴和营、柔肝止痛,茯苓健脾和胃、化痰除湿,青皮行气疏肝;牛膝作为引经下行药,助以补益肝肾、强筋壮骨、通经活络。诸药合用,共奏其功,发挥“从本治痿,从标治痹”作用,切中病机。相关基础研究发现,补肾壮筋汤可降低炎性细胞因子表达,抑制软骨基质中蛋白多糖含量分解,减轻胶原纤维变性程度,发挥延缓骨关节炎的软骨退变作用[19-20]。此外,LIN等[14]研究发现,补肾壮筋汤水提物400 μg·mL-1可显著改善衣霉素诱导的软骨细胞活性,并抑制软骨细胞凋亡,其调控机制为降低Bip、ATF4、Chop、Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA与蛋白含量表达,进而阻止软骨细胞凋亡进程。而TG是Ca2+-ATP酶抑制剂,其作为引起细胞内质网应激反应的诱导剂,可使未折叠或异常折叠的蛋白在软骨细胞内产生蓄积或诱使内质网内Ca2+失稳,引发软骨细胞凋亡[13]。本研究结果发现,补肾壮筋汤干预TG诱导的大鼠椎间盘退变软骨细胞48 h后,可显著下调PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA与蛋白含量表达(P < 0.01),进而提示补肾壮筋汤可通过下调大鼠椎间盘退变关节软骨中与内质网应激相关PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA、蛋白信号分子含量表达,发挥保护大鼠椎间盘软骨细胞作用。

综上所述,补肾壮筋汤延缓大鼠椎间盘软骨细胞退变的机制为通过下调大鼠椎间盘软骨细胞中与内质网应激反应信号通路相关的PERK、Eif2α、ATF4、GADD153 mRNA与蛋白含量表达,这为补肾壮筋汤在临床中治疗脊柱关节退变等疾病提供了部分实验支持;但其发挥调节作用的更深层次的作用机制,如是否通过相应的Lnc RNA与micro RNA进行靶点调节,尚需深入探究。

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收稿日期:2019-05-26;修回日期:2019-08-29