钙离子胁迫条件下苦荞种质资源多样性分析

肖 雪， 章洁琼2， 陈玉琳， 陈庆富， 朱丽伟， 霍冬敖

(1.贵州师范大学，生命科学学院，求是学院，苦荞产业技术研究中心， 贵阳 550025;2.贵州省农作物技术推广总站， 贵阳 550001)

中国西南喀斯特地区以贵州省为中心，该地区是喀斯特地貌分布面积大、发育最典型的片区之一，约占我国喀斯特地区总面积的27%[1]。在自然地理环境中，流水溶蚀石灰岩的基础上外界机械运动形成了独特的喀斯特地貌[2]。喀斯特环境是一个极其特殊的环境系统[3-5]：生境中的基岩多为可溶性碳酸盐岩类，并随着石漠化程度增加，土壤中钙离子呈现正相关，其钙含量约为酸性土壤的3倍[6-7]。钙离子是植物生长发育中必需的矿质元素之一[8]。种子萌发过程中，钙离子通过改变酶活性，进而影响种子萌发速率，但不同植物种子萌发对于钙离子浓度响应不一[9]。

苦荞是双子叶蓼科(Polygonaceae)苦荞属(FagopyrumMill)植物。中国是苦荞的起源地和多样性中心，有着丰富的野生资源和栽培品系[10]。苦荞因其独特的抗旱耐瘠、营养均衡，已成为中西部生态脆弱地区重要的粮经作物[11-12]。近年来，随着我国城镇化率飞速攀升，土地资源无节制开发侵占了耕地资源，脆弱的喀斯特地区农业面临直接威胁。因此，筛选耐受高浓度钙离子苦荞基因资源，对脆弱地区生态保护有着重要意义。

本研究以不同来源地的苦荞资源为研究对象，通过设置不同的钙离子浓度，观察苦荞种子萌发情况，探究适宜苦荞种子萌发的钙离子浓度，为喀斯特等高富集钙离子地区栽种适宜苦荞品系提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所采用的材料来源于5省份共计30份苦荞资源(表3)。

1.2 试验方法：

1.2.1试验设计

试验共设置3个钙离子浓度处理，每重复50粒种子，每处理重复2次。采用无水氯化钙配置钙离子溶液，浓度梯度设置为0，0.075，0.15 mol/L。

1.2.2种子萌发试验

挑选大小一致、健康饱满的苦荞种子，用浓度为1%的次氯酸钠消毒，蒸馏水清洗3～4次后置于铺有2层滤纸的培养皿(直径为9 cm)中，每皿50粒；将上述处理后的种子置于人工培养箱中培养(温度：25 ℃，光照：16 h光照、8 h黑暗)；24 h后记录种子的萌发数(以胚根突破种皮为标准，记录露白粒数)；每天观察情况，直到第5天(每天补充适量溶液)。

1.2.3种子萌发参数的统计

依据苦荞种子萌发特点，借助种子萌发特性分析软件包GERMINATOR[13]中的方法，推算出5个与种子萌发相关指标2 dGR、5 dGR、GI、AUC、T 50，衡量种子发芽特性。其中：

2 dGR：发芽势(%)=(2 d内正常发芽的种子数/每皿总种子数)×100%；

5 dGR：发芽率(%)=(5 d内正常发芽的种子数/每皿总种子数)×100%；

GI：发芽指数=Σ(Gt/Dt)，Dt是发芽日数，Gt为第t天的发芽种子数；

AUC(发芽曲线下面积)：将1～5 d的值连接起来，看覆盖的面积，作为生活力指标；

T 50：发芽率达到50%所需要的时间。

1.3 数据分析

试验采用Microsoft Excel 2016软件和SPSS 20.0软件进行数据处理和统计分析。运用R 3.6.3统计软件(https://www.R-project.org/)基于离差平方和法(Ward)的聚类分析。

2 结果与分析

2.1 钙对苦荞种子萌发的影响

不同钙离子浓度处理下，30种苦荞品系种子萌发参数不尽相同(图1)。苦荞发芽势随钙离子浓度的增加呈先升后降的趋势。钙离子浓度0 mol/L时，发芽势均值为(73.23±10.16)%，当钙离子浓度达到0.075 mol/L时，发芽势快速上升，均值达到(89.27±6.03)%，与0 mol/L时发芽势相比，差异达显著水平。钙离子浓度0.15 mol/L时，发芽势快速下降，均值仅为(47.60±18.73)%。发芽率、发芽指数以及AUC(发芽曲线下面积)参数与发芽势表现出相同趋势。其中AUC指的是将种子萌发1～5 d的值连接起来，所覆盖的面积，该指标可以判定种子的生活力，当钙离子浓度为0.075 mol/L时，AUC均值为(86.93±5.76)%，与钙离子浓度0 mol/L以及0.15 mol/L时相比，AUC参数显著提高。T 50可以衡量种子萌发的一致性。钙离子浓度0.15 mol/L时，T 50均值为(48.65±8.53)h，而当钙离子浓度为0 mol/L和0.075 mol/L时，该参数均值分别为(41.10±4.00)h和(28.80±5.17)h，差异分别达显著。

2.2 苦荞种子萌发参数相关性分析

由表1可知，5个萌发参数均呈极显著相关。其中发芽势、发芽率、发芽指数和AUC成正相关，T 50与这4个参数负相关。

2.3 苦荞耐钙极端种质的初步筛选

综合苦荞萌发参数对30份苦荞种质进行聚类分析，并针对不同类群进行萌发参数方差分析(表2)。在钙离子浓度0 mol/L时，苦荞种质划分为3个大类群(图2)，类群间在发芽势、发芽率、发芽指数、AUC和T 50均存在差异(表2)。钙离子浓度0.075 mol/L时，苦荞种质划分为3个大类群(图3)，类群间在萌发参数存在差异。其中Ca-0.075-II群种质对于低浓度钙离子响应比较灵敏，发芽指数、AUC和T 50与对照相比有显著提升。钙离子浓度0.15 mol/L时，苦荞种质同样划分为3个大类群，类群间在发芽势、发芽率、发芽指数、AUC和T 50均存在差异(图4)。在高钙离子浓度地区，萌发受到影响，但Ca-0.15-II群种质对响应较不敏感，相对萌发参数表现良好。

表1 钙胁迫下苦荞种子萌发参数的相关性分析

注：***:在0.001水平上极显著相关。

表2 不同浓度钙离子处理下苦荞种质聚类分析和萌发参数的差异分析

注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

3 讨 论

在我国中西部喀斯特生态脆弱地区，苦荞因其适应性极强，且富含氨基酸以及生物黄酮类物质，具有极高的营养价值，已逐渐成为出口粮食之一[14]。芽菜苦荞不涉及深加工过程，能最大限度保存营养物质且风味独特[15]，但苦荞种子萌发过程中，存在着种子发芽率低、萌发一致性差等诸多因素，限制了芽菜苦荞的进一步推广。

3.1 钙离子胁迫对苦荞种子萌发的影响

本试验研究表明，苦荞种子发芽势、发芽率、发芽指数和AUC参数均随钙离子浓度的增加表现出现先升后降的趋势。环境钙离子浓度较高时，外界较低的水势胁迫种子吸水困难，呼吸作用受到抑制，进而导致种子萌发率降低[16]。这与李永涛等[17]和蔡喜悦等[7]的研究结果相一致。而吕朝燕等[18]研究表明，低浓度钙离子胁迫可以显著提高紫花苜蓿种子发芽率。刘小丽等[19]通过不同钙离子浓度对香椿种子萌发因素进行研究表明，低钙离子处理同样可以促进种子的发芽指数、活力指数等显著提升。本研究发现，总体上低浓度钙离子对苦荞种子萌发具有促进作用，高浓度钙离子胁迫对苦荞种子萌发起到抑制作用。

3.2 基于复合萌发参数对苦荞芽菜选育

为筛选出耐受喀斯特区域高浓度钙离子苦荞种质资源和苦荞芽菜最优品系，基于种子萌发的5个指标参数将30份苦荞品系进行聚类分析，类群间的方差分析揭示：在钙离子浓度0.075 mol/L时，苦荞Ca-0.075-III群6个品系具有较高的发芽指数、AUC，T 50数值最小，表明这些品系可以作为高种子发芽率、一致性芽菜推荐品系。而在钙离子浓度0.15 mol/L时，Ca-0.15-II群13个品系具有较高的萌发率，可以作为喀斯特高钙区域选育材料进行优系选育。

表3 苦荞种质资源名称及产地