梯棱羊肚菌分子鉴别研究

沈千汇 李春红 谢美霞 李文佳 钱正明,3* 张 霁,*

梯棱羊肚菌分子鉴别研究

沈千汇1李春红2谢美霞2李文佳2钱正明2,3*张 霁1,2*

（1. 华南师范大学脑科学与康复医学研究院，广东 广州 510631；2. 广东东阳光药业有限公司国家中医药管理局重点研究室，广东 东莞 523850；3. 湘南学院，湖南 郴州 423000）

针对羊肚菌品种，特别是产业化培植品种，建立快速准确的品种鉴定方法。通过对来源确切的梯棱羊肚菌样品及同属5种其他羊肚菌进行ITS测序，并结合网络数据库中的梯棱羊肚菌ITS序列进行分析，获得梯棱羊肚菌的特异性鉴别引物。进一步对分子鉴别实验条件进行考察，以确定最终实验条件。通过对梯棱羊肚菌及羊肚菌近缘品种的分析，发现只有梯棱羊肚菌呈现特征电泳条带。表明该研究设计的特异性引物和优化的实验方法，可用于梯棱羊肚菌菌种的快速鉴定及产品的真伪鉴别。

梯棱羊肚菌；分子鉴别；特异性引物；PCR反应

羊肚菌又称羊肚蘑、草笠竹等，因其菌盖多褶皱，子实体似羊肚状凹陷而得名[1,2]。羊肚菌为我国传统中药材和珍稀食材，具有很高的药用及食用价值[3, 4]。一方面由于价格高昂，市场上存在伪品销售的现象，如皱盖钟菌和鹿花菌[5, 6]。伪品若加工处理不当，食用后会出现中毒现象[6, 7]，另一方面，羊肚菌人工栽培近年来得到快速发展，但其菌种存在品种销售混乱等问题。因此，建立快速准确的羊肚菌品种鉴定方法，特别是针对羊肚菌产业化培植品种的真伪鉴别，对保障产业的健康发展具有重要意义。

分子鉴别技术具有准确率高、操作简便等优点，已被广泛应用于冬虫夏草、光慈菇等食药用真菌的真伪鉴别[8-10]。有文献报道采用ITS序列分析方法可鉴定梯棱羊肚菌真伪，但需要的样本量大，测序成本高，分析耗时长，如果样品DNA有断裂或降解则有可能无法进行鉴别[11, 12]。特异性引物分子鉴别是一种专属性强、鉴定速度快的分析方法。本课题组前期采用该技术建立了产业化品种六妹羊肚菌的快速真伪鉴别方法[13]。而另一个大品种梯棱羊肚菌的快速真伪鉴别研究尚未见报道。本试验对梯棱羊肚菌进行特异性引物分子鉴别研究，可为该品种的质量评价技术提升提供支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验收集了18批羊肚菌样品，其中S1～S11均为梯棱羊肚菌，S12～S18为其他品种羊肚菌。相关信息如下：S1采自广东东莞、S2～S4采自广东韶关、S5采自贵州遵义、S6采自四川崇州、S7采自四川南充、S8采自云南丽江、S9采自四川成都、S10采自四川绵阳、S11采自四川广元；S12、S13为六妹羊肚菌，分别采自四川南充和成都；S14、S15为粗柄羊肚菌，来自北京；S16为七妹羊肚菌，来自北京；S17为高羊肚菌，来自北京；S18为小海绵羊肚菌，来自北京。

10条网络数据库中的梯棱羊肚菌ITS系列信息如下：MN462953.1和MN462954.1来自伊比利亚半岛，MK447933.1来自卡拉布里亚（意大利），MH423881.1和MH468775.1来自秦岭地区，MK432691.1来自新西兰，KU865008.1来自塞浦路斯，MK253759.1来自湖南，MH198762.1来自北美西部，MF170632.1来自以色列。

1.2 试剂与仪器

试剂包括：高效植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；PrimeSTAR®Max DNA Polymerase（含HS DNA聚合酶），DL500 DNA Marker，10×Loading Buffer（宝日医生物技术北京有限公司）；琼脂糖，GelRed Nucleic Acid Gelstain（北京全式金生物技术有限公司）。

仪器包括：Vortex Genie 2涡旋振荡器（Scientific Industries, Inc.），XS-205DR电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），MM400混合球磨仪（德国莱驰公司），HWS-24电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），5425离心机（艾本德中国有限公司），ProFlex 3*32 well PCR仪（美国应用生物系统(ABI)公司），ND-2000核酸蛋白仪（美国赛默飞世尔科技公司），XGLDTED脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司），Aqbd Cubee迷你离心机（瑞基海洋生物科技股份有限公司），Tanon 3500凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），PJ210C-BF微波炉（美的集团）。

1.3 方法

（1）样品DNA提取。提取羊肚菌样品（S1～S18）DNA，取适量样品采用混合型球磨仪粉碎。取样品粉末约30 mg至离心管中，使用高效植物基因组DNA试剂盒提取总DNA，并使用核酸蛋白仪测定DNA浓度，将所有样品DNA浓度分别稀释至50 ng/μL，分装放置在－20 ℃下备用。

（2）通用引物PCR扩增。采用真菌通用引物（ITS5F/ITS4R）对所提取的样品DNA进行PCR扩增并测序，得到样品ITS序列。引物信息为ITS5F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR扩增体系总体积25 μL，包含2 × PrimeSTAR Max premix 12.5 μL，ITS5F/ITS4R（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，双蒸水补足至25 μL，并设置阴性对照组（等体积双蒸水代替DNA模板）。PCR反应参数为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃最后延伸10 min。将PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用自动荧光凝胶成像仪检测目标条带，之后将PCR产物送至广州艾基生物有限公司进行双向测序并拼接。

（3）序列分析和引物设计。以11批梯棱羊肚菌的ITS序列和10条该品种网络序列为基础，设计梯棱羊肚菌的特异性引物。所使用的梯棱羊肚菌ITS序列均采用GenBank和MLST数据库验证其准确性[12]。应用DNAMAN软件对11批梯棱羊肚菌的序列和Genbank中下载的10条可靠的梯棱羊肚菌ITS序列进行分析、校对，找出稳定差异的变异位点，并使用Primer Premier 5.0软件对梯棱羊肚菌的特异位点设计了3对特异性鉴别引物对，命名为TL-1s / TL-1a（TL-1s：GTTTGAT TCTGACGTCGGC / TL-1a：CACCAGGGCTAGTA GCTTTAC，166 bp）、TL-2s / TL-2a（TL-2s：ATGA CGCTCGAACAGGCATG / TL-2a：GCCGACGTC AGA ATCATAAC，191 bp）、TL-3s / TL-3a（TL-3s：ATGACGCTCGAACAGGCATG / TL-3a：CACCAG GGCTAGTAGCTTTAC，337 bp），引物由广州艾基生物有限公司合成。

（4）引物筛选及特异性引物PCR条件优化。对所设计的引物对进行筛选和扩增反应条件的优化。以梯棱羊肚菌（S5）DNA为模板，用所设计的3对引物进行扩增，PCR反应采用25 μL反应体系：含2 × PrimeSTAR Max premix 12.5 μL，上下游引物各1 μL（浓度为10 μmol/L），双蒸水 9.5 μL，DNA模板1 μL。PCR参数为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃最后延伸10 min。PCR反应结束后使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

特异性引物PCR条件优化。对特异性引物TL-1s / TL-1a的PCR条件进行以下参数优化：①退火温度设62 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃；②退火时间设10 s、15 s；③延伸时间设10 s、15 s；④反应轮数设30轮、35轮。

（5）方法学考察。分子鉴别研究通常会进行专属性、灵敏度、耐用性的方法学考察[9, 14]。①专属性考察：对所有样品的DNA模板进行PCR扩增，验证所设计特异性引物的专属性，PCR反应参数为“1.3（4）”节优化后的条件，扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。②灵敏度考察：将梯棱羊肚菌（S5）DNA溶液（50 ng/μL）连续稀释至不同浓度（30 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL），PCR反应参数为“1.3（4）”节优化后的条件，扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。③耐用性考察：PCR扩增体系中使用不同体积的引物（0.75 μL，1.0 μL，1.25 μL，1.5 μL），PCR反应参数为“1.3（4）”节优化后的条件，扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及PCR反应条件优化

将3对特异性引物PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶检测，结果表明，引物对TL-1s / TL-1a在166 bp左右能成功扩增出单一的目标条带，另外2对引物显示出假阳性扩增结果和多条非特异性条带，因此选择引物对TL-1s / TL-1a作为梯棱羊肚菌的鉴别引物，并进一步进行PCR反应参数优化。

利用引物TL-1s / TL-1a进行反复试验，最终确定其在退火温度为68 ℃，退火时间为15 s，延伸时间为10 s，反应轮数为35个循环（表1）条件下，不仅能保证扩增稳定进行，而且扩增效率最好。

表1 特异性引物TL-1s/TL-1a的PCR反应条件

2.2 方法学考察

（1）引物专属性考察。利用优化后的反应参数，对11批次的梯棱羊肚菌和7批其他近缘种羊肚菌样品进行分析，结果显示所有的梯棱羊肚菌样品在约166 bp位置均出现唯一目标条带，而阴性对照和其他样品在相应位置均无条带出现（图1），表明该方法专属性良好，能准确地鉴别梯棱羊肚菌与羊肚菌近缘种。

（2）引物灵敏度考察。通过将浓度为50 ng/μL梯棱羊肚菌DNA溶液（样品S5）稀释至不同浓度进行扩增，当浓度为30 ng/μL和10 ng/μL时，目的条带没有明显的差异；当DNA浓度低至约0.1 ng/μL时，PCR产物显示出浅淡的单一目的条带（图2），表明该方法灵敏度高。

（3）引物耐用性考察。通过使用不同引物量（0.75 μL、1 μL、1.25 μL、1.5 μL）进行扩增，结果显示样品在约166 bp位置均出现唯一特征性条带，表明本方法耐用性良好（图3）。

3 结论与讨论

目前羊肚菌培植种源复杂、菌种市场品种掺假混杂等问题严重制约了产业的稳步发展，故羊肚菌品种的鉴定研究对于羊肚菌的产业化栽培和市场产品的质量控制具有重要的意义[15, 16]。近年来，DNA条形码因能快速准确鉴定物种的优势逐渐成为鉴定动植物和真菌的热点技术。其中，ITS序列已被提出可作为真菌遗传鉴定的条形码[17, 18]。现有文献报道了采用ITS序列分析法鉴定梯棱羊肚菌，但用该方法成本高、耗时长，而且若样品中DNA发生降解，ITS序列的通用引物扩增可能不成功，导致无法进行分析[9, 19]。

图A：11批梯棱羊肚菌扩增电泳图。M：DL 500 Marker；泳道1～11分别为样品S1～S11；泳道12：阴性对照。

M：DL 500 Marker；泳道1，2：DNA浓度为50 ng/μL；泳道3，4：DNA浓度为30 ng/μL；泳道5，6：DNA浓度为10 ng/μL；泳道7，8：DNA浓度为1 ng/μL；泳道9，10：DNA浓度为0.1 ng/μL；泳道11，12：DNA浓度为0.01 ng/μL；泳道13：阴性对照。

特异性引物是根据物种间序列差异设计的一段特有DNA序列，在适宜条件下通过特异性扩增，便可完成对指定物种的特异性检验，具有快速、简便和特异性强的优点[13, 14]。本研究基于DNA条形码技术，以梯棱羊肚菌为研究对象，比较序列的差异，在ITS区域内设计了该品种的特异性引物（约166 bp），并确定其最佳PCR反应条件为：98 ℃预变性1 min；98 ℃ 15 s，68 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s进行35个循环；72 ℃最后延伸5 min。该PCR方法耗时约30 min，检测效率高；对不同品种羊肚菌、不同DNA模板浓度、不同引物量的测试结果显示，其具有良好的专属性、灵敏度和耐用性。

M: DL 500 Marker；泳道1，2：引物量为0.75 μL；泳道3，4：引物量为1.0 μL；泳道5，6：引物量为1.25 μL；泳道7，8：引物量为1.5 μL。

本试验采用电子PCR验证所设计引物的应用广泛性，在使用NCBI的Primer-Blast过程中发现，有非梯棱羊肚菌也可能被扩增出来，如六妹羊肚菌（MH468776.1）。进一步通过MLST数据库对六妹羊肚菌（MH468776.1）序列进行比对发现，该序列实际为梯棱羊肚菌。此种情况是由于NCBI中部分序列被错误记录导致的，前期已有文献报道类似情况[4, 12]。

本试验选取GenBank中粗柄羊肚菌（KR809597.1）六妹羊肚菌（KX809733.1）、高羊肚菌（MK890308.1）、七妹羊肚菌（MG589680.1）、黑脉羊肚菌Morchella angusticeps（KM587987.1）的ITS序列，并经GenBank和MLST数据库双库核对准确后，采用NCBI Primer-Blast进行电子PCR验证，结果显示以上5种羊肚菌均未出现特异性片段。说明本试验设计的特异性引物可有效地鉴别梯棱羊肚菌和其他5种羊肚菌。

综上，本研究所建立的分子鉴别方法特异性强、灵敏度高、操作简单、分析速度快，可快速有效鉴别梯棱羊肚菌，为该品种的科学研究、质量评价及菌种市场规范打下了良好的基础。

[1] Du XH, Zhao Q, O'Donnell K, et al. Multigene molecular phylogenetics reveals true morels (Morchella) are especially species-rich in China[J]. Fungal Genetics and Biology, 2012, 49(6): 455-469.

[2] Tietel Z, Masaphy S. True morels (Morchella) - nutritional and phytochemical composition, health benefits and flavor: A Review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2018, 58(11): 1888-1901.

[3] Liu QZ, Ma HS, Zhang Y, et al. Artificial cultivation of true morels: current state, issues and perspectives[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2018, 38(2): 259-271.

[4] 杜习慧, 赵琪, 杨祝良. 羊肚菌的多样性、演化历史及栽培研究进展[J]. 菌物学报, 2014, 33(2): 183-197.

[5] 赵琪, 赵永昌, 李荣春, 等. 皱盖钟菌生态环境调查[J]. 中国食用菌, 2006, 125(4): 22-24.

[6] Arłukowicz-Grabowska M, Wójcicki M, Raszeja-Wyszo-mirska J, et al. Acute liver injury, acute liver failure and acute on chronic liver failure: A clinical spectrum of poisoning due to Gyromitra esculenta[J]. Annals of Hepatology, 2019, 18(3): 514-516.

[7] 李增攀, 黄亮, 曹春水, 等. 毒蕈中毒的分类诊治进展(一)—早发型中毒[J]. 岭南急诊医学杂志, 2008, 13(2): 157-159.

[8] 陈剑山, 郑服丛. ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J]. 安徽农业科学, 2007, 35(13): 3785-3786+3792.

[9] Liu Y, Wang XY, Gao ZT, et al. Detection of Ophiocordyceps sinensis and Its Common Adulterates Using Species-Specific Primers[J]. Front Microbiol, 2017, 8: 1179.

[10] 赵群, 刘枫, 宋向文, 等. 光慈菇药材的特异性PCR鉴定[J]. 中药材, 2017, 40(7): 1540-1546.

[11] 王金秋, 叶鸿亮, 梁道崴, 等. 梯棱羊肚菌子实体转录组测序及解析[J]. 食品科学, 2018, 39(18): 81-87.

[12] Du XH, Zhao Q, Yang ZL,et al. How well do ITS rDNA sequences differentiate species of true morels (Morchella)?[J]. Mycologia, 2012, 104(6): 1351-1368.

[13] Shen QH, Li CH, Xie MX, et al. A Novel PCR-Based Approach for Rapid Identification of Morchella sextelata Using Species-Specific Primers[J]. Current Microbiology, 2020, 77(2): 232-237.

[14] Yang H, Zhou Y, Yu PT, et al. A novel PCR-based technology for rapid and non-sequencing authentication of Bombyx batryticatus using species-specific primers[J]. Natural Product Research, 2019, 33(9): 1251-1256.

[15] 杨燕, 田鸿, 张小平, 等. 基于ITS和ISSR的羊肚菌种质资源遗传多样性分析[J]. 西南农业学报, 2018, 31(10): 2004-2009.

[16] 刘伟, 张亚, 蔡英丽. 我国羊肚菌产业发展的现状及趋势[J]. 食药用菌, 2017, 25(2): 77-83.

[17] Ajmal Ali M, Gyulai G, Hidvégi N, et al. The changing epitome of species identification – DNA barcoding[J]. Saudi Journal of Biological Sciences, 2014, 21(3): 204-231.

[18] Das S, Deb B. DNA barcoding of fungi using Ribosomal ITS marker for genetic diversity analysis: a review[J]. International Journal of Pure & Applied Bioscience, 2015, 3(3): 160–167.

[19] 刘伟, 兰阿峰, 张倩倩, 等. 羊肚菌栽培菌株遗传多样性分析及种特异性RAPD-SCAR标记开发[J]. 菌物学报, 2018, 37(12): 1650-1660.

Molecular identification of

Shen Qianhui1Li Chunhong2Xie Meixia2Li Wenjia2Qian Zhengming2, 3*Zhang Ji1, 2*

(1. Institute for Brain Research and Rehabilitation, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510631, China; 2. Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Sunshine Lake Pharma Co., LTD, Dongguan, Guangdong 523850, China; 3. Xiangnan University, Chenzhou, Hunan 423000, China)

It is important to establish a rapid and accurate method for the identification of species for the cultivation morels varieties. The ITS (internal transcribed spacer) sequences was obtained from all ofand 5 other species of morels collected from different location in China. Combined with reliable online-sequences for homology alignment, the specific-species primers ofwere designed according to the variation sites. And the optimal experimental conditions were obtained by optimizing conditions such as annealing temperature, annealing time and extension time, etc. The developed PCR method was applied in all samples.showed unique characteristic band, and other species of morels had no band. The results showed that the developed specific primer and PCR approach can be used for rapid identification of.

; molecular identification; species-specific primer; PCR

S646

A

2095-0934（2020）03-172-06

工信部年度中药材提升与保障领域项目（2017020）

沈千汇（1995—），女，在读硕士，研究方向为天然与生化药物。E-mail：455230573@qq.com。

钱正明（1982—），男，博士，高级工程师，研究方向为中药质量评价。E-mail：qianzhengming1982@126.com。张霁（1962—），男，博士，药物研发/工艺研发首席科学家。E-mail：zhangjipaper@163.com。