循环肿瘤细胞与其多巴胺受体1表达联合检测在乳腺癌疗效监控中的应用研究

徐 彬，杨清峰，赵小玉，余元勋，李建平，刘 萍，冷雪峰，王迎新

在全球，乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率与死亡数最高的肿瘤，每年乳腺癌新发病例约167.1万，死亡病例约52.2 万[1]；中国乳腺癌发生率占全球发病例数和死亡例数的11.2%和9.2%，乳腺癌的复发率、转移率较高[2]。近年来分子生物液体活检在乳腺癌筛查、监测、转移、复发预测中有较大进展，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是目前生物液体活检中应用较多的疗效监控的肿瘤检测指标，检测 CTCs 有其无创性、可重复性、时效性的特点[3]。CTCs检测技术常用的Cell Search系统，已被美国 FDA 批准可应用于临床检测，计数 CTCs 作为监测转移性乳腺癌无进展生存期和总生存期的预后生物标志物[4]，但单一标志物容易造成部分 CTCs 会被漏检[5]，故联合其他标志物，是提高CTCs检测的敏感度、特异度的重要方法。血液中的乳腺癌CTCs能表达5种多巴胺受体(dopamine receptor，DR)(DRD1,DRD2,DRD3,DRD4,DRD5)[6]等，但在正常造血干细胞不表达；DR有可能成为检测血中CTCs的生物标志物。已有学者正在研发DR调节剂，以进行乳腺癌治疗试验[7]。

现在经常用差相富集-免疫荧光原位杂交技术(subtraction enrichment and immunostaining fluorescence in situ hybridization，SE-iFISH)检测CTCs，同时联合荧光定量PCR技术(fluorescent quantitative PCR，Q-PCR)检测CTC多巴胺受体表达水平，探索其在乳腺癌监测、转移、复发预测中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料样本随机选取自2018年4月～2019年5月安徽省妇幼保健院就诊患者，均为安徽汉族人，共计40例；SE-iFISH测试组包括：① 20例健康体检女性，年龄41～55(48.7±6.16)岁；② 20例为治疗前乳腺癌女性，均未接受相关治疗，年龄48～69(55.6±8.21) 岁。另在20例治疗前乳腺癌女性中选取6例乳腺癌患者为术后观察组。参与研究者，均签署知情同意书。

对SE-iFISH测试组，采集外周血7.5 ml、ACD抗凝，应用SE-iFISH 检测CTCs，评判检测的灵敏度、特异度。再在术后3、6个月对观察组6例乳腺癌患者进行外周血采集、SE-iFISH 检测CTCs、Q-PCR检测CTC DRD1。

1.2 SE-iFISH检测SE-iFISH 检测CTCs的试剂盒，由赛特生物医药科技有限公司提供，具体操作步骤基本如下：

采集7.5 ml外周静脉血到ACD抗凝管中。2 000 r/min离心8 min，去除血浆；在离心管中，加入3 ml密度梯度分离液，离心并去除该分离液上叠加的红细胞。再1 800 r/min离心8 min，将含白细胞和CTCs的液层，吸到另一离心管中，加200 μl磁珠，摇床摇动室温孵育20 min后，1 800 r/min离心8 min，去除白细胞和磁珠，CTCs混合液移到15 ml离心管中。加入抗原修复液修复抗原后，再加入anti-D45抗体与anti-CK18抗体、 抗体稀释液的混合液，室温避光孵育20 min，2 500r/min离心5 min，弃大部分上清液至余下100 μl，沉淀细胞后，加入100 μl固定液混匀、涂片，32 ℃过夜烘干玻片。在玻片进行原位CEP8探针杂交。最后滴加5 μl DAPI染液封片并于荧光显微镜下观察。

结果判读：CTCs的表型为：CK+/CD45-/DAPI+/CEP8+=2；CK+/CD45-/DAPI+/CEP8+>2；CK-/CD45-/DAPI+/CEP8+>2。

1.3 CTCs DR Q-PCR检测采集7.5 ml外周静脉血到ACD抗凝管中。按照上述步骤去除血浆、红细胞、白细胞后，将含有CTCs的细胞混合液，通过细胞总RNA提取试剂盒(DP430)，进行CTCs的RNA抽提，然后用Quant one step qRT-PCR Kit(SYBR Green，FP303)进行 Q-PCR检测。引物序列见表1。最后进行数据分析。

表1 相关引物序列

2 结果

2.1 乳腺癌术后患者CTCs计数与临床病理特征的关系CTCs的计数与乳腺癌的分子分型有关(P=0.007)，但与患者的年龄、肿瘤分期、组织分级、淋巴结转移、病理类型、ER、PR、HER-2、Ki-67 表达情况无关(P>0.05)。见表 2。

表2 20例乳腺癌术后患者CTC计数与临床

2.2 SE-iFISH在乳腺癌外周血CTCs检测中有较高的灵敏度、特异度结果显示，20例健康人CTCs的检出率为0。而随机选取的20例治疗前乳腺癌患者中，18例检出了CTCs(90.0%)，其平均值为7.85 CTCs/7.5 ml外周血(图1A、B、C)。说明该检测方法灵敏度、特异度较好，适合本研究应用。

2.3 DRD1在乳腺癌CTCs上的表达量比DRD2、DRD3和DRD4更高结果显示，20例乳腺癌患者CTCs细胞的DRD 平均CT值：DRD1为21.60、DRD2 为40.02、DRD3为32.62、DRD4为41.40，对照GAPDH为18.68(图2)。与DRD2、DRD3和DRD4的反应CT值比，DRD1的反应CT值较高，可能较适合本实验研究。

图1 SE-iFISH检测CTCs结果 ×400(merge即合并图)

A：20例治疗前乳腺癌患者7.5 ml外周血的CTCs检出值；B图：CTCs细胞相关标志物检测结果；C：红细胞相关标志物检测结果；橙色：CEP8染色；红色：CD45染色；绿色：CK18染色；蓝色：DAPI染色

图2 乳腺癌CTCs细胞的DRD1、DRD2、DRD3

2.4 联合CTCs、CTC DRD1表达量检测对乳腺癌监控有较好的效果为了研究CTCs和CTCs DRD1表达量在乳腺癌病情进展中的变化，选择6例治疗前乳腺癌患者(患者1、2、6为T3期，患者3、4、5为T2期)进入术后观察组，进行术后3、6个月时的外周血采集、SE-iFISH 检测CTCs结果见图3、Q-PCR检测CTCs DRD1见图3；同时结合临床B超、CT检查，观察患者乳腺癌疗效、进展情况。

图3 患者1、2、3、4、5、6术前、术后3、6个月CTCs数值

总体看，结果分两类：第一类是T2期的患者3、4、5的CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct都呈下降趋势(图4)；临床CT、B超等的后续监控结果也显示预后良好。第二类是T3期的患者1、2、6的CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct开始呈下降趋势，后来呈上升趋势(图4)，后续监控发现第二类患者病情预后不良，并发生转移。总体看，两类患者 CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct与T分期、乳腺癌进展有较好的一致性，可以有效辅助临床监控。

3 讨论

Cell Search平台检测的CTCs数量变化对转移性乳腺癌患者有预后价值，可评估转移复发风险，动态监测疗效，指导个体化用药，Yu et al[8]研究发现，乳腺癌患者血常含有间质细胞表型的CTCs，并能通过上皮细胞-间质细胞转化迁入血循环，其中含有少数有高度转移潜能的CTCs，在肿瘤的发生、浸润、进展中有重要作用。乳腺癌患者外周血中CTCs数量极少，约为单个核细胞数目的 1/105[9]，因此要有高度特异和灵敏的CTCs检测方法。本研究通过SE-iFISH CTCs检测，20例健康人CTCs的筛查结果为0，而20例治疗前的乳腺癌患者的CTCs有90%的检出阳性率，说明该方法灵敏度和特异度较好，对后续鉴定所使用标志物的选择更为灵活。

图4 患者1、2、3、4、5、6术前、术后3、6个月CTCs和CTCs DRD1 2-△△Ct监控统计图

Giordano et al[10]分析发现，CTCs能预测转移性乳腺癌患者的生存率，外周血CTCs数量与患者的转移、耐药、预后不良相关。乳腺癌患者在接受有效治疗后，血中CTCs数量会减少。Jiang et al[11]对294例转移性乳腺癌患者研究证实，CTCs在我国转移性乳腺癌监控中有应用价值，115例患者中，检出CTCs≥5/7.5 ml，CTCs数量增加与转移相关。CTCs已被写入美国AJCC指南(第八版)和2019年中国乳腺癌诊治指南，作为远处转移的标准之一。对血CTCs的筛查，有利于发现转移、监测疗效、评估预后[12]。

Sachlos et al[13]发现，DR可能是乳腺癌肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的生物标志物，DR在有5种(正常乳腺干细胞不表达)，参与乳腺癌细胞的增殖、转移，DR拮抗剂硫利达嗪、三氟拉嗪，能抑制CSCs细胞膜的D2受体，抑制CTCs增殖；提示其外周血CSCs的DR是较理想的标志物，与乳腺癌治疗、预后相关，约30% 晚期乳腺癌表达DRD1，常有更大肿瘤、更多淋巴结转移、更短生存[14]。CTCs DRD1的表达量更高，本实验选取检测DRD1。

在进行乳腺癌病情监控时，因各种原因一些受试者未进行多次检测，只有术前检测数据，仅6例乳腺癌患者做了术后3、6个月的DRD1血水平检测。从检测总体结果看，T3期的患者其CTCs和CTC DRD1 术前检出值比T2期患者的高；6个月时复查检出CTCs较多、CTCs DRD1水平升高，后续发生癌症转移，且预后不良。T2期患者6个月复查检出CTCs较少、CTCs DRD1水平降低，其后续预后良好，目前没有复发迹象。但因入组人数较少，监控次数较少，后续还需要继续入组更多的患者，并对其疾病进展进行长期监控，从而获得更多的数据，并进行更加精确的分析以明确CTCs DRD1检测对乳腺癌患者临床应用的价值，为乳腺癌DR靶向药的应用提供更多的理论依据，研究中患者的随访工作还在进行中。