补阳还五汤通过notch信号通路增强神经干细胞移植对脑缺血/再灌注大鼠的脑保护作用

张紫微，翟 羽，张 怡，靳晓飞，董贤慧，高维娟

(河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

缺血性脑卒中是当今常见的高危疾病之一，因缺血后易造成永久性的损伤，且临床治疗手段有限，难以恢复死亡的神经元，所以具有预后不佳、致死、致残率高的特点[1]。近年研究发现神经细胞受损后可以通过神经干细胞(neural stem cells，NSCs)移植来弥补或拯救神经元[2]，成为缺血性脑卒中的新型治疗候选者[3]。Notch信号通路能够调控细胞分化、增殖、凋亡、迁移和血管生成，在决定细胞命运中具有核心作用[4]。研究发现，激活状态下的Notch信号通路主要通过调节下游效应分子Hes1和Hes5来调控NSCs的增殖和分化[5]。补阳还五汤是王清任《医林改错》中的经典方剂，在临床中被广泛用于治疗缺血性脑卒中。补阳还五汤对神经干细胞移植后脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用是本课题组的前期研究结果，并且Notch信号通路抑制剂可以通过影响该通路促进脑缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的神经再生。但是，补阳还五汤对脑缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的脑保护作用是否是通过调控Notch信号通路起作用的，鲜有报导。因此，本研究以脑缺血/再灌注大鼠模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)为研究对象，探讨补阳还五汤是否通过调控Notch信号通路增强神经干细胞移植对脑缺血/再灌注大鼠的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠80只，♂，清洁级，自北京维通利华公司购买，体质量均在(275±2) g。公司生产许可证号为：SCXK(京)2016-0011。

1.2 试剂及药品戊巴比妥钠购于北京化学试剂公司(批号020402)；培养基的组成包括购于Gibco公司的DMEM/F-12(1 ∶ 1)(批号8119014)、B-27(批号1865349)和购于PeproTech公司的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(批号1210432-1)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)(批号1009390)；Notch1(批号5)、Hes1(批号3)抗体购于CST公司，Hes5抗体购于Abcam公司(批号GR214854-7)。DAPI染液(批号180118)、Nestin兔抗大鼠单克隆抗体(批号AF12261998)、Actin抗体(批号LS190312)、以及其他分析纯试剂均购于赛维尔有限公司。补阳还五汤由黄芪120 g，赤芍5 g，当归尾6 g，红花3 g，地龙3 g，桃仁3 g，川芎3 g组成，药材购自河北乐仁堂药业有限公司，煎药浓缩至100 mL(1 mL约含1.43 g生药)。

1.3 主要仪器超净工作台SW-CJ-2FD型、Heal Force二氧化碳培养箱HF240型、Stoelting全自动脑立体定位仪51700型；Leica包埋机EG11508、轮转切片机RM2255、生物显微镜DMI3000B、光学显微镜DM5000B型；Eppendorf离心机；UVP凝胶成像机；Bio-Rad电泳仪、半干转膜仪。

1.4 提取、培养及鉴定NSCs[6]培养基由DMEM/F-12、B27、EGF、bFGF、配置而成。取购自维通利华公司的孕14 d大鼠，麻醉并酒精消毒后，剥出子宫，在超净台内取胎鼠大脑皮质，用眼科剪剪碎后，用手动吹打法使较大的组织变化为细胞悬浊液，并在吹打后使用细胞筛滤过以保证悬液均匀。离心5 min后取出，速率为1 000 r·min-1，倾倒上清液后加培养基，再次吹打悬浮，接种在25 cm2培养瓶，培养于CO2培养箱，密度1.0×109·L-1，恒温37 ℃。在放有多聚赖氨酸包被盖玻片的6孔板中接种已传至第3代的细胞悬液，4 h后显微镜下观察到神经球已粘附于盖玻片，贴孔板侧壁轻柔吸去多余悬液，并用体积分数0.04多聚甲醛固定，15 min后PBS轻柔冲洗3次，每次5 min(后续PBS冲洗均为3次，每次5 min)；室温下质量浓度3 g·L-1TritionX-100孵育，20 min后PBS冲洗；室温下山羊血清封闭，30 min后PBS冲洗。之后滴加Nestin抗体(1 ∶ 200)，在4 ℃环境中孵育，过夜后在室温避光环境下加入二抗(FITC)孵育，1 h后PBS冲洗；滴加DAPI染液孵育，10 min后PBS冲洗；取片加抗荧光淬灭封片剂进行封片，并检测Nestin的表达。

1.5 模型制作及评价大鼠在造左侧MCAO模型前禁食水，术前麻醉使用质量浓度为40 g·L-1的戊巴比妥钠(1 mL·kg-1)根据重量计算后腹腔注射，操作台上固定、消毒、备皮。颈总、颈内和颈外动脉在颈部正中切开2 cm后，分离暴露；结扎3次颈外动脉后在前中结扎点间做一切口，用合适的线栓斜行插入，将颈总、颈内动脉用血管夹夹闭，剪断颈外动脉于后侧结扎点前，借助中部结扎线使颈外离断端与颈内动脉入颅方向一致，松颈内血管夹，插线栓至大脑中动脉,稍有阻力感后停止，线栓进入约(19±1) mm。2 h后拔栓并系死前侧结扎点,碘伏消毒，依次缝合切口,术后动物给与保暖至苏醒[7]。术后24 h，做神经功能评分确定模型是否成功，按Zea Longa 5分制处理：行为无改变为0分；右前爪无法舒展为1分；向右侧行走转圈为2分；行走向右侧歪倒为3分；丧失自发活动与意识为4分。0分、4分动物死亡为模型失败，不予选取，将1～3分大鼠纳入实验对象。

1.6 分组及给药实验分组为假手术组(Sham)、模型组(Model)、补阳还五汤组(BYHWT)、移植组(Transplant)、补阳还五汤+移植组(BYHWT+Transplant)，每组各16只；其中假手术组只分离血管，其余4组随机平均分配64只模型成功大鼠。BYHWT组与BYHWT+Transplant组于手术麻醉清醒2 h后，灌胃给予补阳还五汤，给药剂量为14.8 g·kg-1·d-1，每日灌药量分两次给予，连续灌胃14 d，其余3组给予等体积蒸馏水。各组大鼠于NSCs移植后第14 d进行取材。

1.7 NSCs移植[8]模型制作24 h后进行NSCs移植，麻醉消毒，固定大鼠于脑立体定位仪上,以前囟为坐标零点定位:AP=0.36 mm,ML=3.15 mm,DV=5.5 mm,微量注射器注射速度:1 μL·min-1，细胞浓度为1.0×106·L-1，注入NSCs 10 μL于大鼠左侧纹状体区，完毕后留针10 min拔针，消毒缝合。

1.8 TTC染色检测大鼠迅速断头取脑，在置于质量浓度20 g·L-1的TTC染液前，放在-20 ℃环境15 min,并于取出后的脑槽内做5片，2 mm厚冠状切片；37 ℃恒温箱中避光孵育,10 min后翻面1次,20 min后在体积分数0.04的多聚甲醛中固定。24 h后拍照，脑梗死体积图片的分析使用Image-Pro Plus 6.0软件。

1.9 HE染色观察梗死区脑组织细胞体积分数为0.04的多聚甲醛灌注取脑，脑组织石蜡包埋，做冠状切片，厚5 μm。60 ℃烘烤石蜡切片2 h后，依次于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中脱蜡 ，每次15 min，然后于梯度乙醇脱水，每次5 min，依次为体积分数1的乙醇Ⅰ、Ⅱ和体积分数0.8的乙醇；蒸馏水复水、苏木素染液染色各5 min，流动水轻洗数秒，分化3 s，水洗反蓝少于30 s，过洗2 s，伊红染液浸染1～3 min，蒸馏水轻洗1～2 s；再次梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，树胶封片，镜下拍照，进行细胞计数，并观察脑组织神经细胞损伤情况。

1.10 Western blot法检测各组大鼠快速在冰上断头，取缺血侧脑组织；称重后，加入裂解液匀浆，取上清(组织总蛋白)。BCA法进行蛋白浓度测定。加样后，用SDS-PAGE凝胶电泳，传至PVDF膜；室温下，质量浓度50 g·L-1脱脂奶粉封闭，2 h后分别加入兔抗大鼠Actin(1 ∶ 2 000)、Notch1、Hes1、Hes5(1 ∶ 1 000)抗体，4 ℃孵育过夜；室温下加入二抗(1 ∶ 2 000)孵育，1 h后洗膜，避光并滴加ECL显影，于化学发光成像系统观察。以β-actin作内参照，以目的条带灰度值与内参照条带灰度值之比分析蛋白质的相对表达。

2 结果

2.1 神经干细胞的证明如Fig 1所示，在倒置显微镜下对培养6 d的新生大鼠脑组织原代细胞进行观察，观察发现:视野中存在多个悬浮、规则、无突起的桑葚状致密细胞球和大量单细胞。免疫荧光染色检测结果显示:具有荧光特性的FITC标记的Nestin发出绿色荧光；细胞核被DAPI核染，发出蓝色荧光，表明Nestin表达呈阳性，提示培养的细胞为NSCs。

2.2 神经功能学评分比较如Fig 2，Sham组为0分。Model组较Sham组评分增加(P<0.05)；BYHWT组、Transplant组和BYHWT+Transplant组较Model组评分均降低(P<0.05)；BYHWT+Transplant组较Transplant组评分进一步降低(P<0.05)。

Fig 1 Immunofluorescence identification of neural stem cells

A: 6 d neural stem cells; B: Positive cells were stained with nestin immunofluorescence; C: DAPI; D.Merge

Fig 2 Neurological score of each group

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vstransplant group.

2.3 脑梗死体积比较如Fig 3所示，Sham组无白色梗死灶形成。与Sham组比较，Model组缺血侧梗死区体积较大(P<0.05)； BYHWT组、Transplant组和BYHWT+Transplant组较Model组相比，梗死体积均缩小(P<0.05)；BYHWT+Transplant组较Transplant组梗死体积进一步缩小(P<0.05)。

2.4 缺血侧脑组织HE染色比较如Fig 4所示，Sham组大鼠脑组织神经细胞大小形态基本一致，分布均匀、致密，结构正常，胞质充盈，核仁清晰，未见空泡状水肿和变性，未见明显核固缩与核溶解；与Sham组比较，Model组大鼠脑组织大量细胞受损严重，分布稀疏，出现较多空泡状水肿、变性，以及核固缩和核溶解，皱缩细胞核数量增多(P<0.05)；BYHWT组、Transplant组和BYHWT+Transplant组分别与Model组比较，细胞状态表现出不同程度的减轻，核收缩和溶解的细胞数有一定程度的降低(P<0.05)；BYHWT+Transplant组较Transplant组损伤程度进一步减轻(P<0.05)。

Fig 3 TTC staining results of each group

2.5 各组Notch1、Hes1、Hes5蛋白表达如Fig 5所示，Sham组 Notch1、Hes1、Hes5蛋白均有一定量的表达，与Sham组比较，Model组Notch1、Hes1、Hes5蛋白表达水平均上调(P<0.05)；BYHWT组、Transplant组、BYHWT+Transplant组较Model组，各项蛋白表达均有所上调(P<0.05)；BYHWT+Transplant组较Transplant组各项表达上调(P<0.05)。

3 讨论

缺血性脑卒中的治疗是当今备受关注和亟待解决的关键问题，如何有效缓解脑损伤成为治疗的首要关注点。脑损伤的修复受到多种因素的调控，其中通过经典的Notch信号通路调节NSCs的增殖和分化被多数研究认可[9]。Notch通路受体蛋白(Notch1～4)激活后与相邻配体结合，经过多次介导启动下游碱性螺旋-环-螺旋基因：Hes1和Hes5效应分子转录。研究证明，机体调控NSCs的增殖、分化与Notch1、Hes1和Hes5的活化密切相关。NSCs细胞周期的退出以及过早分化与Notch1受体表达减弱有关；Hes1与抑制NSCs分化有关；而Hes5可以促进NSCs的增殖，它们共同参与维持神经细胞数量与种类的稳定[10]。

Fig 4 HE staining of brain tissues in each group of rats (Bar=100 μm)

脑卒中属于中医中风病的范畴，缺血性脑卒中的主要病机为气虚血瘀。针对病机治疗的补阳还五汤在长期临床实践中证明疗效卓越。现代医学研究发现补阳还五汤可以从抑制神经细胞凋亡、抑制细胞毒性、抑制炎症介质等方面负向调控；也可以从促进NSCs增殖分化、促进相关生长蛋白表达、促进信号通路激活等多个方面正向调控，共同发挥对神经细胞的保护作用[11]。

Fig 5 Western blot results

本研究结果显示在脑缺血/再灌注损伤发生后，MCAO大鼠脑组织Notch1、Hes1、Hes5表达显著升高，表明机体内源性激活Notch1、Hes1、Hes5，参与修复受损部位，与涂建锋等[12]的研究结果一致。单纯进行补阳还五汤与单纯进行外源性NSCs移植治疗14 d后，Notch1、Hes1、Hes5表达增加，脑组织细胞与神经功能有所恢复，说明Notch信号通路被激活并对脑缺血/再灌注损伤有保护作用[13-14]。然而前期研究结果显示，外源性NSCs移植治疗7 d后Notch相关蛋白表达减少，神经保护作用与Notch通路促进外源性NSCs的分化有关[8]，结合本实验我们猜测NSCs移植对Notch信号通路的影响可能是动态的，结果的差异性可能是因为NSCs移植在抑制Notch通路而促进外源性NSCs分化的同时，还参与了脑组织内环境与炎症反应的改变[15]，故表现为前期外源性NSCs分化程度较内源性NSCs增殖程度明显，但是随着时间的增加，外源性NSCs分化逐渐稳定，炎症反应降低，内环境相对稳定，使Notch信号通路被激活，促进内源性NSCs增殖。随后我们研究脑缺血/再灌注损伤的修复作用是否能在NSCs移植与补阳还五汤的共同作用下，通过调控Notch信号通路而提高。研究结果证实：BYHWT+Transplant组各项蛋白明显上调，脑组织与细胞的恢复明显优于Transplant组。由此我们认为补阳还五汤可能是通过上调Notch信号通路，为移植后的内源性NSCs长期保持增殖水平提供了保障，提高了内源性NSCs增殖的潜能，弥补了移植后快速分化带来的治疗短暂性，从而增加了NSCs移植对脑缺血/再灌注损伤治疗的持续性，并发挥更持久的脑保护作用。