吲哚三甲醇对心肌细胞脂毒性损伤的保护作用及其机制研究

李 帅，鲍翠玉，李 晶

(湖北科技学院1. 药学院、2. 糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100)

糖尿病是一种对医疗保健系统造成严重经济影响的发病率越来越高的代谢性疾病[1]，近年来，糖尿病心血管病变在致病率及致死率方面受到了广泛关注[2]，其中，糖尿病性心肌病的高发生率的防治成为了很多研究的重点内容。据文献报道，糖尿病心肌病的发病机制与脂质代谢异常相关[3]，经常伴有相关的脂肪酸代谢失调。在糖尿病啮齿动物模型和肥胖患者中，尽管出现了高胰岛素血症和高血糖症，但心肌的损害几乎完全依赖于脂肪酸的利用，体内葡萄糖氧化速率被过量的饱和脂肪酸所抑制，心肌的耗氧加剧，体内出现氧化还原失衡，出现过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，心肌内出现脂质堆积，导致心肌氧化损伤[4-5]。

吲哚三甲醇属于如甘蓝、白菜等十字花科蔬菜中的有效成分，在胃酸中吲哚三甲醇可以转化成一系列寡聚物如3，3′-二吲哚甲烷，最终在体内发挥生物效用。据报道，吲哚三甲醇具有抗肿瘤作用，其作用机制涉及到很多通路[6]。但吲哚三甲醇对心肌细胞脂毒性损伤的保护作用及其机制目前尚无报道。基于此，本研究将以AMPK信号通路为切入点，探讨吲哚三甲醇对心肌细胞脂毒性损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂 AMPKα(#2532)、p-AMPKα(Thr172，#2535)、mTOR(#2972)、p-mTOR(Thr172，#2971)、p70S6K(#9202)、p-p70S6K(Thr389，#9206)、Bcl-2(#15071)、Bax(#5023)、cleaved caspase-3(#9661)、β-actin(#3700)抗体，购自美国CST公司；棕榈酸(palmitic acid，PA，#292125)、吲哚三甲醇(#17256)，购自美国Sigma公司；DMEM培养基，购自美国HyClone公司；胎牛血清，购自浙江天杭生物科技股份有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，购自VazymE公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，购自贝博生物；活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒，购自大连美仑生物技术有限公司；MTT检测试剂盒，购自碧云天公司。H9c2大鼠心肌细胞，购自上海通派生物有限公司。

1.1.2仪器 恒温空气浴摇床(上海福玛实验设备有限公司)；超净工作台(苏州净化公司)；细胞CO2培养箱(Thermo公司)；CKX41倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；电泳槽、电转膜仪(Bio-Rad公司)；多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；化学发光凝胶成像系统(英国Syngene公司)。

1.2 方法

1.2.1PA及吲哚三甲醇的配制 用0.1 mol·L-1的NaOH溶液，在70 ℃水浴中溶解一定量的PA，振荡混匀10 min，过滤，配成100 mmol·L-1的PA储存液。在55 ℃水浴中，用去离子水配制50 g·L-1的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，过滤。用PA储存液和BSA溶液制备混合液，体积比值为1 ∶ 19，经振荡和水浴后，室温下冷却过滤后，用细胞培养基稀释制备工作液。吲哚三甲醇则溶解于DMSO，使母液浓度达到100 mmol·L-1，使用前将其融于DMEM(含血清、双抗)达到工作液浓度，涡旋混匀后使用。

1.2.2细胞培养 DMEM培养基中加入双抗、10%胎牛血清，用于培养H9c2心肌细胞，当细胞的贴壁密度处于70%～80%时，用含有0.25% EDTA的胰酶轻轻吹打消化、传代至所需培养皿中进行实验。

1.2.3MTT检测细胞增殖 实验分组：① PA浓度梯度:control组(空白对照组加入同等体积的PBS)、PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)刺激24 h组，进行MTT检测。② PA时间梯度:control组(空白对照组加入同等体积的PBS)、PA(0.4 mmol·L-1)刺激0、12、24、48 h组，进行MTT检测。③ 吲哚三甲醇作用实验：control组(空白对照组加入同等体积的PBS)、PA 0.4 mmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 μmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1组、吲哚三甲醇200 μmol·L-1组，含吲哚三甲醇培养基预处理1 h后吸出培养基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培养基。④吲哚三甲醇浓度梯度:control组(空白对照组加入同等体积的PBS)、吲哚三甲醇(25、50、100、200 μmol·L-1)刺激24 h组，进行MTT检测。

MTT检测采用96孔板接种细胞，细胞密度为每毫升1×106个，每孔100 μL，培养24 h后给药，进行孵育，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)，在37 ℃细胞培养箱孵育4 h，吸除上清，每孔加入 150 μL DMSO，振荡混匀后，用酶标仪检测570 nm处的各孔OD值。细胞增殖率/%=OD处理孔/OD阴性对照孔×100%。

1.2.4ROS水平检测 ROS水平检测采用6孔板接种细胞，分为以下几组：control组、PA 0.4 mmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 μmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1组、吲哚三甲醇200 μmol·L-1组，含吲哚三甲醇培养基预处理1 h后吸出培养基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培养基。分组给药后，在37 ℃细胞培养箱放置24 h，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后，每孔加入DHE(10 mmol·L-1)，在37 ℃细胞培养箱放置30 min，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后，荧光显微镜的激发波长设置为480～535 nm，发射波长设置为590～610 nm，并用ImageJ 1.41分析软件选取5个不同的视野进行平均荧光强度统计分析。

1.2.5细胞凋亡检测 采用6孔板接种细胞，分为以下几组：control组、PA 0.4 mmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 μmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1组、吲哚三甲醇200 μmol·L-1组，含吲哚三甲醇培养基预处理1 h后吸出培养基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培养基。分组给药后，在37 ℃细胞培养箱放置24 h，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后，每孔加入4%多聚甲醛，固定10 min后，用PBS洗涤细胞3次，每次5 min。每孔加入400 μL Annexin V-FITC 结合液，再向每孔加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，放入细胞培养箱等待10 min，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后进行封片，用荧光显微镜检测荧光，FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.2.6免疫印迹法检测蛋白表达 细胞凋亡检测采用培养皿接种细胞，分为以下几组：control组、PA 0.4 mmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 mmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1组、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1组、吲哚三甲醇200 μmol·L-1组，含吲哚三甲醇培养基预处理1 h后吸出培养基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培养基。分组给药后，在37 ℃细胞培养箱放置24 h，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后，每皿细胞进行裂解，将细胞刮下，离心收集沉淀，蛋白含量检测采用BCA试剂盒。定量后，取20 μL的蛋白样品进行上样，采用5%～15%的SDS-PAGE分离胶进行蛋白电泳，采用PVDF膜进行2 h转模，室温下采用5%的脱脂奶粉进行1 h的封闭，4 ℃下加入一抗孵育24 h，加入PBS后洗涤5 min，重复3次后，室温下加入HRP标记的二抗孵育1 h，用ECL化学发光显影，然后凝胶成像系统检测AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、β-actin的表达水平，以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达水平。

2 结果

2.1 吲哚三甲醇对高脂诱导的心肌细胞增殖能力低下的影响体外培养H9c2心肌细胞，用含PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)的DMEM培养基刺激24 h。如Fig 1A所示，心肌细胞增殖率随着PA浓度的增加呈现下降趋势，PA浓度在0.4 mmol·L-1时，降低明显(P<0.05)。Fig 1B结果显示，含PA 0.4 mmol·L-1的DMEM培养基刺激细胞0、12、24、48 h后，心肌细胞增殖率随着PA刺激时间的延长呈现下降趋势，尤其在24 h时，细胞增殖率开始明显降低(P<0.05)。因此，我们将PA浓度定为0.4 mmol·L-1，刺激时间24 h开展下一步实验。如Fig 1C所示，PA组心肌细胞增殖率明显下降，随着预处理的吲哚三甲醇浓度的升高，PA+吲哚三甲醇组的细胞增殖率呈现浓度依赖性升高趋势。尤其吲哚三甲醇在200 μmol·L-1时，细胞增殖率明显恢复至正常水平，同时如Fig 1D所示，心肌细胞增殖率并未随着吲哚三甲醇浓度的增加呈现下降趋势。因此在下一步实验中吲哚三甲醇浓度设置为200 μmol·L-1。

2.2 吲哚三甲醇对高脂诱导的H9c2细胞内ROS水平及凋亡水平的影响如Fig 2所示，PA组的红色荧光明显增强，而PA+吲哚三甲醇组的红色荧光明显弱于PA组，接近正常组。如Fig 3所示，0.4 mmol·L-1PA刺激24 h后，细胞内Annexin V-FITC标记的绿色荧光及PI 标记的红色荧光明显增强，而吲哚三甲醇预处理组可以明显逆转上述荧光改变。

Fig 1 Viability of H9c2 cells treated with PA alone or combination of PA and indole-3-carbinol

A:Concentration-dependent cell damage induced by PA at 24 h stimulation time.*P<0.05vs0 mmol·L-1group. B:Time-dependent cell damage induced by PA at 0.4 mmol·L-1concentration.*P<0.05，**P<0.01vs0 h group. C:Viability of cells treated with varied drugs (culture time:24 h).*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group. D:Concentration-dependent cell damage induced by indole-3-carbinol at 24 h stimulation time.

Fig 2 Effect of indole-3-carbinol on PA-induced cardiomyocyte oxidative damage(scale bar:50 μm)

A:The intracellular level of ROS in H9c2 was estimated by DHE，a fluorescent probe; B:Fluorescence intensity of DHE.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

Fig 3 Effect of indole-3-carbinol on PA-induced cardiomyocyte apoptosis(scale bar:50 μm)

The intracellular apoptosis level in H9c2 was estimated by Annexin V-FITC/PI labelled fluorescent probe.

2.3 吲哚三甲醇对高脂诱导的心肌细胞AMPK及凋亡通路的影响如Fig 4A所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培养基刺激H9c2心肌细胞24 h时，p-AMPKα表达明显下降(P<0.05)，而p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达明显升高；预处理吲哚三甲醇组可以明显逆转心肌细胞内高脂诱导的p-AMPKα蛋白的降低及p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达的升高(P<0.05)。如Fig 4B所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培养基刺激H9c2心肌细胞24 h时，Bcl-2水平明显下降(P<0.05)，而Bax、cleaved caspase-3表达均明显升高(P<0.05)。而预处理吲哚三甲醇组可以明显逆转心肌细胞内高脂诱导的Bcl-2蛋白表达的降低及Bax、cleaved caspase-3蛋白表达的升高(P<0.05)。

3 讨论

1972年，Rubler等在无明显冠状动脉粥样硬化的糖尿病患者中观察到一种心肌病。1974年，Hamby等通过病理研究，提出了糖尿病心肌病的概念，它是糖尿病引起心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死，早期通常表现为心肌顺应性降低和舒张期充盈受阻为主的舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，易发生充血性心力衰竭，是一种独立的原发病，其发病不依赖于高血压、冠状动脉疾病。

Fig 4 Effect of indole-3-carbinol on expression of AMPK/p70S6K pathway-related proteins(A) and apoptosis-related proteins(B) in cardiomyocytes induced by

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

糖尿病心肌病的发病因素较多，其中高脂毒性是重要原因之一[7]。高脂毒性是指血游离脂肪酸水平增高[8-9]，超过脂肪组织的储存能力和非脂肪组织对游离脂肪酸的氧化能力，以三酰甘油的形式在脂肪组织、非脂肪组织过度沉积，引起脂质异位贮存。血游离脂肪酸高水平上调数分钟，就可使细胞的葡萄糖摄入、利用及糖原合成减少，可损害胰岛素受体信号通路的活性，激活炎症因子，引起胰岛素抵抗，促进血胰岛素水平升高；可使线粒体产生ROS增多，激活终末糖基化产物通路、PKC通路、己糖胺通路等，导致细胞损伤。动物实验也证实，高脂血症可以导致心肌脂质沉积、心室壁增厚、心室重构、心脏收缩功能降低。本研究证实，高脂可以诱发心肌细胞增殖率明显下降，而吲哚三甲醇可以明显逆转心肌细胞脂毒性损伤。

心肌脂毒性损伤的发病机制复杂，与多条信号通路相关，尤其是AMPK相关通路已成为近年来的研究热点[10-12]。机体存在氧化-抗氧化的平衡机制，基于此，我们检测了心肌细胞内ROS的生成和凋亡水平，发现高脂可以明显增加心肌细胞内ROS的水平，并促进心肌细胞凋亡，而吲哚三甲醇预处理可以明显逆转高脂诱导的上述指标的变化。提示吲哚三甲醇可以明显抑制高脂诱发的细胞内氧化应激。AMPK属于关键的能量传感器，据报道，2型糖尿病病人的骨骼肌中，磷酸化的AMPK表达明显下降[13]。可见，AMPK的激活对慢性病的防治具有重要意义。mTOR及p70S6K属于AMPK信号的下游特异性蛋白，AMPK磷酸化的抑制及mTOR、p70S6K磷酸化的增强，被视作疾病对AMPK通路调控机制之一[14-15]。本研究结果提示，高脂刺激组心肌细胞内p-AMPKα的表达明显降低，p-mTOR及p-p70S6K蛋白的表达明显升高，而吲哚三甲醇预处理可以明显逆转高脂所致的p-AMPKα蛋白的表达降低及p-mTOR、p-p70S6K蛋白的表达升高。这些结果表明，吲哚三甲醇可以调控细胞内AMPK信号通路，保护心肌细胞出现脂毒性损伤。本研究结果还提示，高脂诱发心肌细胞促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低，而吲哚三甲醇明显逆转高脂所致心肌细胞凋亡。

综上所述，吲哚三甲醇能成功逆转高脂所致的心肌细胞增殖力下降，缓解氧化应激损伤，通过调控AMPK信号通路，最终减少心肌细胞凋亡，起到保护心肌细胞的作用，目前吲哚三甲醇对心肌细胞脂毒性损伤的保护作用及其机制国内外尚无报道，本研究为吲哚三甲醇治疗心肌细胞脂毒性损伤奠定了理论和实践基础。