以红宝石无核葡萄为亲本胚挽救育种技术的研究

郭艳芳，张 娜，田淑芬，月 丫

（1.天津市设施农业研究所，天津300192；2.天津师范大学生命科学学院，天津300387；3.天津农学院，天津300384）

在葡萄育种工作中，选育品质优良的无核葡萄新品种是一项重要内容[1].在常规的杂交育种中，选配杂交组合亲本时，无核品种只能作父本同有核品种杂交，在这样的杂交组合中，后代的无核几率通常低于15.9%[2]. 1982 年，Ramming等[3]创立了胚挽救技术，以无核葡萄为母本胚挽救获得了后代，使得无核葡萄作母本成为可能[3].胚挽救技术可以提高后代的无核率，缩短育种周期，已被广泛应用于无核葡萄的种质创制中[4-5].通常不同葡萄品种以及不同杂交组合间的胚挽救效果存在很大差异[6-8].染色体是基因的主要载体，其数目和形态是区别不同物种的重要标志之一.染色体计数法是以植物的根尖、茎尖、卷须、叶片、愈伤组织等为材料观察细胞染色体数目，确定植物倍性的最基本和最精确的方法.在葡萄育种研究中，对染色体进行观察是鉴定后代及亲本材料的重要方法.如晁无疾等[9]以葡萄的卷须为材料，用改良的去壁低渗法观察染色体数目；郭紫娟[10]以葡萄茎尖为材料，采用去壁低渗法观察了75个葡萄品种品系的染色体；常金华等[11]通过观察卷须和茎尖的染色体数目，鉴定出玫瑰香葡萄的多倍体变异植株.

红宝石无核葡萄（Red Ruby Seedless）是晚熟无核品种，果穗大，外形呈长圆锥形，果肉较脆，味甜低酸，品质佳，非常适合鲜食[6].本研究以红宝石无核葡萄为亲本，基于无核葡萄胚挽救影响因子的研究基础[7-8]，探究不同亲本、取样时间以及培养基对红宝石无核×希姆劳特（Himrod Seedless）、红宝石无核×玫瑰香（Muscat Hamburg）、红宝石无核×巨玫瑰（Jumeigui）优系葡萄杂交后代胚发育萌发的影响，并对亲本及杂交后代进行了染色体倍性鉴定以确定杂交是否成功.本研究以期为筛选出优良的葡萄胚挽救育种组合，提高无核葡萄幼胚的离体发育、萌发和成苗提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

材料选自天津市农业科学院现代农业创新基地，2018 年4 月—10 月在天津市农业科学院现代农业创新基地和天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室进行实验.共计3个杂交组合，如表1 所示.

表1 胚挽救杂交组合设计Tab.1 Cross combinations of embryo rescue

1.2 方法

1.2.1 田间杂交授粉

根据当年母本植株开花情况，待5%左右的小花开放时，选取生长健壮、饱满的花穗剥离花冠，取出花药，去除花丝，在自然条件下阴干，收集到装有变色硅胶的玻璃小瓶里，保存于4 ℃冰箱，授粉时备用[12-14].花前1～2 d 对母本进行人工去雄，每个组合去雄15 穗，去雄后即刻套袋，第2 天开始授粉，每天授粉2 次，连授3 d，每次授粉完即刻套袋，并标识杂交组合和授粉时间.

1.2.2 幼果采集

不同葡萄品种的幼果取样时期不同，开始取样后每7 d 取样1 次，连取3次.取样时期均为花后54、61和68 d.将幼果带果柄采回后放置在4 ℃冰箱中备用.

1.2.3 胚珠离体培养

对幼果进行计数，冲洗消毒后置于无菌培养皿中，用解剖针剥取胚珠，分别接种在N1 培养基（Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3 + 60 g/L蔗糖+5 g/L 琼脂+1 g/L 活性炭，pH 值为5.8）和E1 培养基（ER+1.5 mg/L IAA +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+60 g/L 蔗糖+5 g/L 琼脂+1 g/L 活性炭）中，于（25±2）℃培养室内培养，每个瓶中接入15个胚珠[15].胚珠离体培养60 d 后，计算胚发育率（%）=发育胚数/接种胚珠数×100.

1.2.4 胚离体培养

胚珠离体培养60 d 后，在超净工作台进行剥胚工作.将离体胚分成2 组，分别接种到W1 培养基（WPM+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗糖+5 g/L 琼脂+1.5 g/L 活性炭，pH 值为5.8）和M1 培养基（1/2MS+0.1 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+1 g/L 活性炭+5 g/琼脂L+1.5 g/L 活性炭）中，于（25±2）℃培养室内培养.剥胚时，若剥出亮白色的胚，则视为胚发育；若胚珠内无胚或胚褐化，则视为胚败育[16].胚萌发培养30 d 后，统计胚萌发率，50 d 后统计成苗率.

1.2.5 染色体倍性鉴定

用根尖染色体计数法对红宝石无核×巨玫瑰杂交苗及亲本进行倍性鉴定.取根尖在清水中冲洗，放入0.002 mol/L 的8-羟基喹啉溶液中处理3～4 h.蒸馏水洗净冲洗3 次，于卡诺固定液中固定24 h.将固定后的根尖用蒸馏水冲洗3 次，浸于70%的酒精后，于4 ℃冰箱保存.取保存的根尖，用蒸馏水冲洗3 次，浸泡于1 mol/L HCl 中，60 ℃水浴锅中解离8～10 min.蒸馏水冲洗3 次，用改良的石碳酸品红溶液染色15 min. 留染色后根尖0.2～0.5 cm，滴1 滴石碳酸品红染液进行盖片、压片，光学显微镜观察染色体并计数.

1.3 数据统计与处理

采用WPS 软件和SPSS 17.0 软件对实验数据进行处理和方差分析（P ＜0.05）.

2 结果与分析

2.1 不同父本对胚挽救结果的影响

比较各杂交组合授粉后杂交胚的发育率和萌发率，结果如表2 所示.由表2 可以看出，以玫瑰香和巨玫瑰葡萄为父本的胚发育率和萌发率均显著高于以希姆劳特葡萄为父本的胚挽救发育率，即有核葡萄为父本比无核葡萄品种为父本的胚发育率和萌发率高.

表2 不同父本对胚挽救结果的影响Tab.2 Effects of different male parent on embryo rescue

2.2 取样时期对胚生长发育的影响

3个杂交组合在不同取样时期胚的生长发育情况如表3 所示.由表3 可以看出，各组合的胚发育率和胚萌发率均在花后61 d 取样最佳，显著高于其他取样时期的胚发育率和胚萌发率.

表3 不同取样时期下幼胚生长发育情况Tab.3 Growth and development situation of embrgo in different sampling dates

2.3 不同发育培养基下幼胚的生长发育情况

分别采用N1 和E1 培养基对红宝石无核×玫瑰香和红宝石无核×希姆劳特杂交胚珠进行发育培养，结果如表4 所示.

表4 不同发育培养基下幼胚发育情况Tab.4 Growth and development situation of embrgo in different developed medium

由表4 可以看出，2 组杂交胚在N1 培养基上的发育率（13.92%、8.00%）均显著高于在E1 培养基上的发育率（9.57%、6.54%）.因此从发育率来看，N1 培养基更适合2个杂交组合离体胚珠的发育，且无论是在N1培养基还是E1 培养基上，红宝石无核×玫瑰香葡萄杂交组合的胚珠发育率均比红宝石无核×希姆劳特葡萄杂交组合的胚珠发育率高，差异具有统计学意义（P ＜0.05）.

2.4 不同萌发培养基下幼胚的生长发育情况

分别采用W1 和M1 培养基对红宝石无核×希姆劳特和红宝石无核×玫瑰香的杂交胚进行培养，结果如表5 所示.

表5 不同萌发培养基下幼胚生长发育情况Tab.5 Growth and development situation of embryo in different germination medium

由表5 可以看出，红宝石无核×希姆劳特的离体胚在W1 培养基上培养后，胚萌发率为50.40%，成苗率为14.49%，显著高于经M1 培养基培养之后胚的萌发率（35.37%）和成苗率（0）.红宝石无核×玫瑰香的离体胚在M1 培养基上的胚萌发率（65.59%）显著高于其在W1培养基上的胚萌发率（54.94%），但成苗率为4.05%，在W1 培养基上的成苗率为17.09%，表明M1 培养基适合红宝石无核×玫瑰香杂交胚的萌发，W1 培养基更利于其成苗.

2.5 染色体倍性鉴定

对红宝石无核×巨玫瑰杂交苗及亲本进行染色体倍性鉴定，共获得9 株杂种胚挽救幼苗，其中4 株为三倍体（triploid hybrid）幼苗，5 株为二倍体（diploid hybrid）幼苗.不同亲本及杂交苗的染色体倍性鉴定结果如图1 所示.

图1 红宝石无核×巨玫瑰杂交苗及亲本的根尖染色体Fig.1 Root tip chromosome of hybrid single plant and parent of Red Ruby Seedless×Jumeigui

3 讨论与结论

无核葡萄胚挽救育种过程中，亲本基因型是决定胚发育萌发的首要因素.母本基因型对胚挽救效果的影响程度较大，同时父本也对胚挽救效率有一定的影响[17].本研究以红宝石无核葡萄为母本，分别以希姆劳特无核、玫瑰香和巨玫瑰为父本，探究不同父本基因型对无核葡萄胚挽救效果的影响，并对红宝石无核×巨玫瑰亲本及杂交后代进行染色体倍性鉴定以确定杂交是否成功.研究结果表明：以巨玫瑰葡萄为父本的胚挽救效果最好，胚的发育率和萌发率显著高于以玫瑰香葡萄为父本的数值；以希姆劳特葡萄为父本的胚发育率和萌发率最低，胚挽救效果最差.

由于无核葡萄发育过程中胚珠有一个急剧败育期[18]，因此了解胚珠的败育时期适时接种具有重要意义[19].本研究中3个杂交组合授粉后54 d 和68 d 的胚发育率和萌发率均显著低于授粉后61 d 的数值，即最佳取样时间为授粉后61 d，此时红宝石无核×巨玫瑰的杂交胚发育率和萌发率均显著高于其余2个杂交组合的胚发育率和萌发率.适宜的培养基是影响胚生长发育的另一个重要因素. 本研究比较了E1 和N12 种发育培养基对胚发育的影响，发现后者更适宜于胚的生长发育.比较红宝石无核×希姆劳特和红宝石无核×玫瑰香2个杂交组合的离体胚珠分别在2 种发育培养基上的胚发育率，发现红宝石无核×玫瑰香的发育优势显著.将2个组合的离体胚在W1 和M1培养基上萌发培养60 d 后，发现W1 培养基更适合红宝石无核×希姆劳特离体胚的萌发培养，红宝石无核×玫瑰香组合在M1 培养基上的胚萌发效果较好，但在W1 培养基上的成苗情况较好.