抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 定性PCR 检测方法

李葱葱 谢苹 董立明 夏蔚 兰青阔 闫伟 龙丽坤 李飞武

（1. 吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，长春 130033；2. 天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381）

根据农业生物技术应用国际服务组织（International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications，ISAAA）最新统计显示，2017 年全球转基因玉米种植面积达到5 970 万hm2［1］。转基因技术已成为新的农业科技革命的强大动力。随着转基因作物种植面积的持续增长和全球公众对于转基因植物及其产品安全性的关注度不断提升，包括我国在内的全球62 个国家相继颁布实施了转基因生物标识管理制度［2-3］。根据我国《农业转基因生物安全管理条例》及其配套管理规章的规定，我国对农业转基因生物及其产品实行安全评价、产品标识、生产许可、经营许可、进口许可、加工许可等制度。其中，针对各个转基因作物转化体建立特异、灵敏、标准化的检测方法是保证标识管理制度顺利实施的重要技术支撑［4］。

转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 是由北京奥瑞金公司研发的转mG2-aroA基因和mcry1Ah基因抗虫耐除草剂玉米新品系。研发人采用农杆菌转化法，将mG2-aroA和mcry1Ah两个外源基因的表达框导入玉米受体中，然后通过多代筛选获得对玉米螟、黏虫等鳞翅目害虫具有抗性、耐草甘膦除草剂的转基因玉米GH5112E-117C 转化体［5］，该转化体正在申请生产应用安全证书阶段，在我国具有重要产业化应用前景。建立GH5112E-117C 玉米的检测方法，将对该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 转基因玉米GH5112E-117C、转 基 因 玉 米 混 合 样 品（Bt11、Bt176、MON810、M O N 8 6 3、G A 2 1、N K 6 0 3、T 2 5、T C 1 5 0 7、MON88017、MIR604 每种转化体含量为1%，以非转基因玉米为填充物）；转基因大豆混合样品（包括GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、A5547-127、356043、305423、CV127 每种转化体含量为1%，以非转基因大豆为填充物）；转基因水稻混合样品（包括科丰6 号、科丰8 号、克螟稻、M12、TT51-1 每种转化体含量为1%，以非转基因水稻为填充物）；转基因棉花混合样品（包括MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913 每种转化体含量为1%，以非转基因棉花为填充物）；转基因油菜混合样品（包括MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2 每种转化体含量为1%，以非转基因油菜为填充物）；非转基因玉米样品。以上样品均由本实验室收集保存。

植物基因组DNA 提取试剂盒；Taq DNA 聚合酶、dNTPs 等PCR 试剂；其他生化试剂（分析纯）。

1.1.2 仪器与设备 C1000 型梯度PCR 仪；GelDoc XR+凝胶成像系统；ND8000 紫外可见光分光光度仪。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 将所有样品研磨成粉末，按照北京天根公司的植物基因组DNA 提取试剂盒操作说明书，提取样品基因组DNA，用紫外可见光分光光度仪测定DNA 质量和浓度，用1×TE 缓冲液将纯化的DNA 溶液稀释至25 mg/L，4℃保存备用。

1.2.2 引物设计 根据奥瑞金公司提供的GH5112E-117C 玉米外源载体插入片段的5′端和3′端侧翼序列信息，采用引物设计软件Primer Premier 5.0，综合考虑核苷酸序列GC 含量和引物Tm 值，设计 了1 对PCR 检 测 引 物，GH5112-117C-F：5′- ACCAGCACCAGGTCCGAGTTGAGA -3′；GH5112-117C -R：5′- CCCAGGTACATTAAAAACGTCCGC -3′，扩增产物大小为179 bp。引物由上海生工有限公司合成，用1×TE 缓冲液稀释至10 μmol/L 的工作液。

1.2.3 PCR 反应 优化后的PCR 反应体系包括：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 混合溶液2 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、HS Taq DNA 聚合酶0.625 U、DNA 模板50 ng，用ddH2O 补齐至25 μL。优化后的PCR 扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，进行35 个循环；72℃ 5 min；10℃保存。PCR 扩增结束后，取10 μL 扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2 结果

2.1 特异性检测

将抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 制备成质量分数为1%的粉末作为测试样品，利用5 种转基因作物混合样作为比对样品，对建立的抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 定性PCR 方法进行特异性测试，测试样品和比对样品均以转基因材料与非转基因材料作为填充物进行混合磨制而成，提取DNA 按照要求进行PCR 反应。

检测结果（图1）表明，仅从含有GH5112E-117C 玉米的测试样品中扩增到179 bp 的预期DNA片段，而在其他样品中均未扩增到预期大小的条带，表明建立的抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 玉米检测方法具有高度特异性。

2.2 灵敏度测试

将抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 与其非转基因按不同质量比混合，制成GH5112E-117C 转化体质量分数分别为1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的样品，提取基因组DNA，进行PCR 扩增。

图1 抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 检测方法的特异性测试

结果（图2）显示，利用建立的方法在PCR 检测反应体系中加入50 ng DNA 模板，在GH5112E-117C 转化体含量为0.05%及以上的样品中均能稳定得到与预期大小一致的扩增产物，表明方法的灵敏度可达到0.05%。

图2 抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 检测方法的灵敏度测试

在使用普通PCR 进行转基因成分定性检测时，一般要求方法的检测限应稳定达到0.1%。根据国际公认的检测限判定程序，随机称取60 份GH5112E-117C 玉米质量分数为0.1%的样品，提取基因组DNA，用本方法进行测试。结果如图3 所示，60 份试样中连续59 次检出预期片段，表明在PCR 检测反应体系中加入50 ng DNA 模板时，本方法的检出限为0.1%，适用于对抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 品系的高灵敏检测。

2.3 加工品测试

加工品中的高温处理过程往往会降解DNA，对转基因检测有较大的影响。为测试本研究建立的GH5112E-117C 玉米检测方法对加工品的适用性，采用两种常用的高温方法制备了2 份GH5112E-117C 玉米加工品，1 份是将质量分数为1.0%的GH5112E-117C 玉米粉末制成玉米面窝头，并蒸熟；另一份是将质量分数为1.0%的GH5112E-117C 玉米粉末在121℃下高温高压处理20 min。提取2 份加工品的基因组DNA，进行PCR 扩增。结果（图4）表明，利用建立的方法在2 份加工品中均能特异性地扩增到179 bp 的预期产物，表明该方法适用于GH5112E-117C 玉米加工品的定性PCR 检测。

图3 抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 检测方法的检出限测试

图4 抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 检测方法对加工品的测试

2.4 稳健性测试

针对PCR 检测方法的反应体系和反应程序，选择退火温度和引物浓度梯度两个关键参数进行正交试验。设置50、52、54、56、58 和60℃等6 个 退火温度，0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L 和0.5 μmol/L 等5 个引物浓度梯度，每对引物共测试30 个退火温度/浓度梯度组合。结果（图5）表明，在不同的引物浓度和退火温度处理中本方法均表现出非常好的扩增特异性，而且，当引物终浓度为0.2 μmol/L 时，不同退火温度表现出较为一致的扩增效率，特异性扩增条带清晰、无非特异扩增、引物二聚体较少。综合考虑玉米内标准基因zSSIIb的定性PCR 检测方法的反应体系和反应程序，结合本研究结果，反应体系中的引物终浓度确定为0.2 μmol/L，反应程序中的退火温度设定为58℃。

3 讨论

随着转基因技术的发展，全球转基因玉米种植面积持续增长和全球公众对于转基因植物及其产品安全性的关注度不断提升，转基因玉米的研发也迅速发展［6］。转基因玉米检测方法的研发，对农业转基因生物及其产品实行安全评价、产品标识、生产许可、经营许可、进口许可、加工许可等制度的实施提供了重要技术支撑［7］。

在转基因产品检测过程中，PCR 技术因其特异性强、灵敏度高、重现性好，应用最为广泛［8］。根据所检测的目的DNA 片段的特异性差异，转基因产品PCR 检测方法又可分为筛选、基因特异性、构建特异性和转化体特异性4 类［9］。其中，转化体特异性PCR 检测方法以转基因生物的旁侧序列（与外源插入片段连接的受体基因组序列）与外源插入片段的连接即转化体特异序列为检测对象，具有高度特异性，已逐步成为国际上转基因产品检测方法标准的首选［10］，我国近年来发布的检测方法标准绝大多数为转化体特异性检测方法。本研究开发的方法是精准检测转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 的一种新的技术手段。该方法具有低成本、便利、普及性高的技术优势，但是检测通量、精准定量和自动化检测方面。还存在一定的技术弊端。因此，本研究下一步将开发该转化体实时荧光PCR［11］和数字PCR 方法［12］。

4 结论

本方法以转基因抗虫耐除草剂玉米GH5112E-117C 转化体特异性DNA 序列为靶标，能特异性地检测样品中是否含有GH5112E-117C，检测灵敏度可稳定达到0.1%。