白藜芦醇对糖尿病小鼠肾脏自噬水平及肾间质纤维化的影响*

赵俊琳， 张莹莹， 段玲弟， 赵思琪， 阮媛媛， 彭 灿， 张 帆， 郭 兵

（贵州医科大学病理生理学教研室，贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，贵州贵阳550025）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种目前在全世界范围内发病率呈持续增长的慢性内分泌紊乱性疾病，而糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是DM较为常见的微血管并发症，也是导致终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）及死亡的主要原因之一［1］。肾小管间质纤维化是DN发展至ESRD的主要病理改变之一，其中肾小管上皮细胞向间充质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在促进肾间质纤维化中扮演着重要角色［2］，但是其具体发生机制迄今尚未充分阐明。自噬是一种保守的蛋白降解过程，细胞利用溶酶体清除衰老的蛋白质及受损的细胞器，对维持自身稳态和细胞完整性有重要意义。既往研究表明，DN大鼠肾组织中的自噬水平显著受到抑制［3］，而提高其自噬水平能显著抑制肾纤维化及DN的发生发展［4］，表明自噬与DN的发生发展密切相关［5］。

白藜芦醇（resveratrol，Res）别名虎杖苷元，广泛存在于葡萄等植物中，具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗组织纤维化等多方面的生物药理活性［6-8］。Res可以防治DN的发展［4，7-9］，但其潜在的机制还不完全清楚。为此本项工作采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）构建1型DM小鼠模型，观察予以Res干预后对DM小鼠肾脏纤维化病变及自噬水平的影响，旨在进一步明确Res对DN肾间质纤维化的作用，探讨其可能的作用机制。

材料和方法

1 动物

健康清洁级雄性6周龄C57BL/6小鼠24只，体重（20±5）g，斯贝福（北京）生物技术有限公司购买，许可证号：SCXK（京）2016-0002。正常饲养在25℃恒温的设施中，人工光照、阴暗各12 h，给予标准的清洁级饲料，适应性喂养1周。

2 主要试剂与仪器

STZ（Sigma）；Res（纯度＞98%；VETEC）用质量分数0.5%的羧甲基纤维素钠配制成混悬液后备用；抗β-actin抗体（普美生物）；抗α-SMA和抗E-cadherin抗体（Abcam）；抗IV型胶原（collagen type IV，Col IV）抗体（Sigma）；抗微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和抗Snail1抗体（Cell Signaling Technology）；抗beclin-1抗体（Proteintech）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔和羊抗小鼠IgG（博士德）；ECL化学发光试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物研究所）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜 和 Whatman 3MM滤纸（Millipore）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）；TB GreenPremix Ex TaqTMII（TaKaRa）；组织研磨器（新芝）；AU680全自动生化分析仪（Beckman Coulter）；Scope A1正 置 显微镜（Zeiss）；凝胶成像系统和荧光定量PCR仪（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 动物模型的制备及分组 将24只C57-BL/6小鼠适应性喂养1周，随机分为正常对照（normal control，NC）组、DM组和Res组，每组8只。后两组造模前称重，禁食6 h，乙醚麻醉，腹腔注射溶于无菌柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5，0.01 mol/L）的STZ（55 mg·kg-1·d-1），连续5 d，复制DM小鼠模型。NC组予腹腔注射等体积STZ溶媒枸橼酸钠缓冲液。尾静脉采血测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），以FBG≥16.7 mmol/L且稳定1周者为造模成功。成模8周后，Res组采取灌胃方式予以Res干预，Res溶于0.5%的羧甲基纤维素钠中，灌胃剂量为10 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次，现配现用。DM组和NC组予等体积的质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠，每日灌胃1次，连续给药12周后处死所有小鼠。期间所有小鼠予标准饲料喂养，自由饮水，每周监测1次血糖和体重。

3.2 血、尿及肾组织采集 处死前1 d收集24 h尿液并记录尿量，离心后取部分上清用于检测尿蛋白；处死前禁食6 h，乙醚麻醉称重后，眼眶取血，1 467×g离心10 min分离血清检测生化指标。取血后剪开腹腔暴露双侧肾脏，在冰上轻柔去除肾脏外包膜及周围脂肪组织，记录双侧肾脏重量，取部分组织固定于4%的中性甲醛，做成石蜡切片后行病理检测，其余部分切开肾脏并去除肾髓质，-80℃超低温冷冻保存，用于提取蛋白和RNA分别行Western blot和realtime PCR检测。以肾重（mg）/体重（kg）比值作为肾脏指数（kidney index，KI）。

3.3 生化指标检测 用葡萄糖氧化酶法测FBG，氧化酶法测血清肌酐（serum creatinine，SCr），免疫比浊法测尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER），邻苯三酚红钼法测尿总蛋白（urinary total protein，UTP）。以UTP乘以24 h尿量计算24 h UTP。以UAER乘以24 h尿量计算24 h UAER。

3.4 肾组织形态学观察 取部分肾组织固定于4%的中性甲醛，经包埋、固定，做成3μm厚的石蜡切片，脱蜡后行HE和Masson染色，普通光学显微镜下观察各组肾组织的形态学变化。

3.5 Western blot法检测各组肾组织中纤维化指标、EMT指标及自噬标志蛋白的表达水平 称取0.2 g肾皮质组织于1.5 mL高压灭菌过的EP管内，加入1 mL组织蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=97∶3），管内放入磁珠，经组织研磨机充分研磨成液体。4℃、13 201×g离心，取上清，BCA法蛋白定量，根据浓度加入适量上样缓冲液，充分混匀后，100℃沸水中加热10 min。上样，经SDS-PAGE分离，以300 mA电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜，10 min，3次，然后分别加 I抗［β-actin（1∶4 000）、LC3（1∶1 000）、beclin-l（1∶1 000）、Col IV（1∶500）、α-SMA（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和 Snail1（1∶1 000）］，4℃孵育过夜。次日回收I抗，TBST洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的II抗（1∶5 000），常温孵育1 h，洗膜，放入ECL显影液（1∶1）中，避光混匀，Bio-Rad凝胶成像仪曝光，Image Lab 5.1软件选中条带并分析灰度值，结果用目的蛋白与β-actin相对表达量表示。

3.6 Real-time PCR检测α-SMA、E-cadherin和Col IV的mRNA表达 取0.1 g肾组织皮质部分加1 mL TRIzol提取小鼠肾组织RNA，于核酸蛋白分析仪260/280 nm测定RNA的浓度及纯度后，根据Therom试剂盒将RNA逆转录成cDNA，然后按照TaKaRa TB GreenPremix Ex TaqTMII 20μL体系试剂盒操作，应用DNAMAN软件设计α-SMA、E-cadherin、Col IV及β-actin引物，由上海生物工程有限公司合成，用Bio-Rad CFX96TM荧光定量PCR分析系统进行检测，同时采用熔解曲线分析评价PCR结果的可靠性。PCR程序为：95℃ 3 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，39个循环；72℃10 s。以β-actin为内参照，待测基因的相对表达量以2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=［Ct目的基因（待测样品）-Ct内参照（待测样品）］-［Ct目的基因（校正样品）-Ct内参照（校正样品）］。引物序列见表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers used in real-time PCR

4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行分析，数据都以均数±标准差（mean±SD）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠代谢及生化指标比较

DM组FBG、KI、SCr、24 h UAER及24 h UTP均显著高于NC组（P＜0.05），Res组KI、SCr、24 h UAER及24 h UTP均显著低于DM组（P＜0.05），而DM组和Res组FBG无显著差异（P＞0.05），见表2。

2 各组肾组织的病理变化

HE及Masson染色可见，NC组小鼠肾小管结构较清晰，上皮细胞排列整齐，基底膜较完整，间质炎性细胞浸润及胶原沉积不显著；与NC组相比，DM组小鼠肾小球充血扩张，部分肾小管上皮细胞空泡、坏死、萎缩脱落，肾小管管腔扩张，肾小管及肾间质周围炎症细胞浸润伴有显著的蓝色胶原纤维沉积；与DM组相比，Res组小鼠肾脏病变有所减轻，肾小球充血较轻，肾小管间质纤维化病变亦减轻，胶原沉积减少，见图1。

表2 各组代谢及生化指标比较Table 2.The kidney index（KI），fasting blood glucose（FBG），24-hour urinary albumin excretion rate（24 h UAER），24-hour urine total protein（24 h UTP）and serumcreatinine（SCr）in each group（Mean±SD.n=8）

Figure 1.The histological changes of the renal tissues in each group.图1 各组肾组织的形态学观察

3 各组肾组织中纤维化指标Col IV及EMT相关指标α-SMA、E-cadherin和Snail1的表达水平

DM组肾组织中Col IV、α-SMA和Snail1蛋白表达较NC组显著上调，E-cadherin蛋白表达较NC组显著下调（P＜0.05）；而Res组肾组织中Col IV、α-SMA和Snail1蛋白表达较DM组显著下调，E-cadherin蛋白表达较DM组显著上调（P＜0.05），见图2A。DM组肾组织中Col IV和α-SMA的mRNA表达较NC组显著增高，而E-cadherin的mRNA表达显著降低（P＜0.05）；与DM组比较，Res组E-cadherin的mRNA表达增高（P＜0.05），而Col IV和α-SMA的mRNA表达降低（P＜0.05），见图2B。

4 各组肾组织中自噬相关指标beclin-1和LC3-II的蛋白表达水平

与NC组相比，DM组自噬标志蛋白beclin-1蛋白表达减少，LC3-II/LC3-I比值下降（P＜0.05）。与DM组相比，Res组beclin-1蛋白表达显著增多，LC3-II/LC3-I比值升高（P＜0.05），见图3。

讨 论

DN是ESRD的主要病因之一［1］，其病理改变主要为肾小球硬化和肾间质纤维化，而肾间质纤维化的主要表现为肾小管上皮细胞损伤及大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积。肾小管上皮细胞的EMT在促进ECM的沉积、肾间质纤维化及DN的发生与发展中起着重要的作用［2，9］，其中转录抑制因子Snail1可能作为EMT的始动因子发挥着关键作用［10］。Snail1可以与E-cadherin启动子区E盒结合，抑制E-cadherin的表达，同时还可以诱导α-SMA的表达。在高糖培养的肾小管上皮细胞中，促进上皮细胞Snail1的表达能促进EMT的发生，而抑制Snail1的表达则能抑制EMT的发生［11-12］。本实验中DM组的生化指标和病理形态学均提示糖尿病肾病肾间质纤维化动物模型复制成功。与NC组相比，DM组中α-SMA、Col IV和Snail1的表达增加；E-cadherin的表达减少（P均＜0.05），说明在这个过程中发生了纤维化病变及EMT。

自噬是细胞内溶酶体依赖性蛋白降解的两种途径之一［13］，在代谢、退行性和恶性疾病等许多生理和病理情况下具有重要作用［14-15］。Huang等［8］检测到db/db小鼠肾组织中的自噬水平明显受到抑制，其中beclin-1是自噬启动的关键蛋白，有文献报道在DN大鼠模型及高糖培养的肾小管上皮细胞模型中beclin-1的表达及自噬水平均明显降低［5，16］。我们的研究结果显示，随着纤维化病变的进展，DM组小鼠肾组织中beclin-1和LC3-II蛋白表达水平较NC组显著下调，自噬水平减弱。这表明自噬不足可能参与了糖尿病肾纤维化的发生发展，而上调自噬水平可能作为DN治疗的一个潜在靶点［5］。另外，增加beclin-1的表达能提高细胞自噬水平，抑制EMT的发生［17］。本研究结果显示，与NC组相比，DM小鼠肾组织的beclin-1表达减少而Snail1表达水平显著升高，纤维化病变明显，提示beclin-1调控的自噬与EMT关系密切。

Figure 2.The protein and mRNA expression levels of fibrosis index collagen type IV（Col IV）and EMT-related indexesα-SMA，E-cadherin and Snial1 in renal tissues of each group.A：the protein levels of Col IV，α-SMA，E-cadherin and Snial1 were determined by Western blot.B：the mRNA levels of Col IV，α-SMA and E-cadherin were determined by real-time PCR.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup；#P＜0.05，**P＜0.01 vs DMgroup.图2 各组肾组织中纤维化指标Col IV及EMT相关指标α-SMA、E-cadherin和Snial1的蛋白和mRNA表达水平

Figure 3. The protein levels of beclin-1 and LC3 IIin renal tissues of each group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCGroup；##P＜0.05 vs DM Group.图3 Western blot显示各组肾组织中自噬相关指标beclin-1和LC3-II的蛋白表达水平

Res是一种来源于花生、葡萄、桑葚等植物的天然多酚类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等功效，有很好的食用价值和药用价值。近年来国内外研究表明Res具有防治DN的作用［4，18-19］，但是具体机制尚不明确。He等［19］发现Res能抑制高糖培养的肾小管上皮细胞发生EMT。在DN大鼠模型中，Res可通过恢复肾组织自噬水平改善肾功能［4］。我们的实验结果显示，DM小鼠接受Res干预后，自噬水平上调，纤维化病变程度显著减轻。与DM组相比，beclin-1表达水平显著升高，而Snail1表达减少，纤维化病变及EMT减轻。以上研究结果提示Res可能通过促进beclin-1的表达，上调自噬水平，促进Snail1的降解，减轻肾脏纤维化，抑制DM小鼠肾间质纤维化及EMT的发生发展，从而发挥保护肾脏的作用。

综上所述，Res对DN的保护作用，可能是通过上调beclin-1介导的自噬水平，下调Snail1的表达，从而延缓肾脏纤维化的进程，对肾脏起到保护作用。但是在DN中，beclin-1与Snail1之间的具体关系还不是很清楚，有待深入研究。