白头翁皂苷A通过调控miR-24-3p/RNF2的表达影响乳腺癌细胞增殖及放射敏感性*

邹晓静， 郝燕燕△， 胡一迪， 谢燊侠， 白 薇

（温州市中医院 1检验科，2甲乳外科，浙江温州325000）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，目前治疗主要 以手术结合放化疗为主，但化疗易耐药及放射不敏感是困扰临床的重要问题［1］，因此寻找有效治疗乳腺癌的药物及增强放化疗敏感性的药物是目前研究的重点。研究表明，中药治疗乳腺癌具有毒副作用小、效果好等特点，对乳腺癌的预防效果显著，且一些中药对肿瘤细胞具有放疗增敏的效果［2］。白头翁是一种中草药，具有抗肿瘤、抗氧化及促进免疫等作用［3］。且研究报道白头翁皂苷D体外可诱导肺腺癌细胞凋亡［4］；白头翁皂苷A（Pulsatilla saponin A）可抑制人非小细胞肺癌的生长，增强肿瘤细胞放射敏感性［5］。此外，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）也与肿瘤的发展和放疗敏感性相关，如miR-24-3p可增强鼻咽癌细胞的放射敏感性［6］，miR-24-3p可促进乳腺癌细胞增殖和侵袭［7-8］。然而白头翁皂苷A在体外对乳腺癌细胞增殖及放射敏感性的影响还尚未见报道。因此，本研究拟探讨白头翁皂苷A对人乳腺癌MCF-7细胞放射敏感性的影响及其机制是否与miR-24-3p有关。

材料和方法

1 材料与试剂

人乳腺癌MCF-7细胞购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清和DMEM培养液（Gibco）；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒（TaKaRa）；Taq DNA Polymerase和AceQ qPCR SYBR®Green Mix（Vazyme）；LipofectamineTM2000转染试剂盒（Invitrogen）；MTT、蛋白提取试剂盒和BCA试剂盒（上海碧云天公司）；白头翁皂苷A（湖北万得化工有限公司）；miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p载体质粒（上海吉玛生物公司）。［60Co］医疗照射装置（中国核动力研究院）。

2 白头翁皂苷A储存液的配制

称取白头翁皂苷A 0.668g，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液33.4 mL，配成浓度为20 mg/L的储存液，搅拌均匀后，抽滤无菌培养，-20℃避光保存，使用时按所需浓度按比例稀释。

3 方法

3.1 细胞培养 MCF-7细胞常规培养于含10%FBS的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2恒温箱培养。每2～3 d传代一次。

3.2 细胞转染和分组 参考彭超军［5］的实验方法，取对数生长期细胞消化后，接种于96孔板（每孔1×104个）培养，DMEM培养液培养24 h后，吸去原培养液，换成终浓度分别为0、5、10、15和20 mg/L的白头翁皂苷A的DMEM培养液，记为不同浓度白头翁皂苷A处理组。不添加白头翁皂苷A的作为对照组，以终浓度为10 mg/L的白头翁皂苷A培养MCF-7细胞，记作白头翁皂苷A组。

取常规培养的乳腺癌MCF-7细胞消化后接种于6孔板中，待细胞生长至80%融合，更换为无血清培养液同步化12 h，随后进行转染。将miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p质粒分别转染至乳腺癌MCF-7细胞中，记为miR-NC组、miR-24-3p组、anti-miR-NC组和anti-miR-24-3p组，转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

取部分anti-miR-NC组和anti-miR-24-3p组的细胞分别加10 mg/L的白头翁皂苷A培养48 h，记为白头翁皂苷A+anti-miR-NC组和白头翁皂苷A+antimiR-24-3p组。

3.3 MTT法测定白头翁皂苷A对乳腺癌MCF-7细胞活力的影响 取以上各组细胞，在其培养至48 h时每孔加入20μL质量浓度为5 g/L的MTT试剂，继续孵育4 h，加入150μL的DMSO，震荡混匀，在酶标仪测定各孔吸光度（A450）值。实验重复3次，每组设3个复孔取均值，将对照组细胞抑制率设定为0%。其余各组细胞抑制率（%）=（1-实验组A/空白对照组A）×100%。

3.4 集落形成实验 取对照组、白头翁皂苷A组、白头翁皂苷A+anti-miR-NC组、白头翁皂苷A+antimiR-24-3p组、miR-NC组和miR-24-3p组细胞，分别给予0、2、4、6和8 Gy的［60Co］照射。照射后，按照射剂量大小分别以 0.3×103、1×103、1×103、3×103和 3×103的细胞密度接种于60 mm的培养皿中，继续培养10～14 d。PBS清洗2遍后甲醇固定15 min，吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数＞50个细胞的集落。平板效率（plating efficiency，PE；%）=集落数/接种细胞数×100%。存活分数（survial fraction，SF）=照射剂量组集落数（/该组细胞接种数×未照射组PE）。采用多靶单击模型拟合细胞存活曲线，SF=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×ln N。其中D为照射剂量（Gy），D0为平均致死剂量，Dq为准阈剂量（代表存活的宽肩度），N为外推值。放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）=单纯照射组D0/加药联合照射组D0。

3.5 RT-qPCR分析miR-24-3p和环指蛋白2（ring finger protein 2，RNF2）的mRNA表达水平 按照TRIzol说明书提取总RNA，用反转录试剂盒逆转录成cDNA，按照AceQqPCR SYBR®Green Mix说明书进行RT-qPCR扩增。循环条件为：95℃30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。实验均重复3次，每次设3个复孔。

3.6 Western blot检测RNF2蛋白表达 提取各组细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。各组蛋白上样量60μg，SDS-PAGE后，经电转将蛋白转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭90 min，分别加入相应的Ⅰ抗，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入相对应的Ⅱ抗室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次10 min，暗室中显影，定影。采用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的A值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。实验均重复3次，每次设3个复孔。

3.7 萤光素酶报告基因实验检测miR-24-3p对RNF2的靶向调控 TargetScan数据库显示RNF2的3′-UTR有miR-24-3p的结合位点。构建野生型和突变型RNF2的3′-UTR萤光素酶表达载体（WT-RNF2和MUT-RNF2），取对数生长期MCF-7细胞接种于24孔板（每孔1×103个），待细胞生长至80%融合时，用LipofectamineTM2000将WT-RNF2和MUT-RNF2质粒分别转染细胞，同时分别转染miR-24-3p和miR-NC。依据说明书要求，使用萤光素酶报告基因检测仪进行双萤光素酶报告基因实验。实验结果以萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性的比值进行统计学分析。实验重复3次，每次设3个复孔。

4 统计学处理

采用GraghPad Prism 5拟合细胞存活曲线。采用SPSS 20.00进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度的白头翁皂苷A对MCF-7细胞活力的影响

用不同浓度的白头翁皂苷A处理乳腺癌MCF-7细胞48 h后，乳腺癌MCF-7细胞的活力抑制率随着白头翁皂苷A的浓度升高而显著升高（P＜0.05），见表1。白头翁皂苷A的浓度为10 mg/L时，细胞活力抑制率为50%左右，因此我们将10 mg/L作为后续实验用药浓度。

2 白头翁皂苷A对MCF-7细胞放疗敏感性的影响

集落形成实验后，通过多靶单击模型拟合计算得出，在MCF-7细胞中对照组和白头翁皂苷A组的D0值分别是2.846和1.517，白头翁皂苷A的SER是1.876，见表2。细胞存活拟合曲线显示，在同一剂量照射下，白头翁皂苷A联合照射组的SF小于单纯照射对照组，存活曲线下移（P＜0.05），见图1。

表1 不同浓度的白头翁皂苷A对MCF-7细胞活力的影响Table 1.Effect of different concentrations of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

表2 对照组和白头翁皂苷A组的多靶单击模型参数Table 2.The parameters of multitarget single-hit model in control and Pulsatilla saponin A groups.

Figure 1.Survival curve of MCF-7 cells after different doses of irradiation.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group.图1 不同剂量照射后MCF-7细胞的存活曲线

3 白头翁皂苷A对MCF-7细胞中miR-24-3p和RNF2表达的影响

相较于对照组，白头翁皂苷A组中miR-24-3p的表达水平显著升高，RNF2的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图2、表3。

4 miR-24-3p靶向调控RNF2的表达

Figure 2.RNF2 protein electropherogram of control and Pulsatilla saponin A groups.图2 对照组和白头翁皂苷A组的RNF2蛋白电泳图

表3 白头翁皂苷A对MCF-7细胞中miR-24-3p和RNF2表达的影响Table 3.Effect of Pulsatilla saponin A on expression of miR-24-3p and RNF2 in MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

通过TargetScan数据库预测到RNF2与miR-24-3p存在结合位点，见图3A。萤光素酶报告基因实验结果显示，转染WT-RNF2的MCF-7细胞中，miR-24-3p组的萤光素酶活性较于miR-NC组显著降低（P＜0.05）；而转染MUT-RNF2的细胞中，两组的萤光素酶活性无显著差异，见表4。相较于miR-NC组，miR-24-3p组MCF-7细胞中RNF2蛋白的表达显著降低；而相较于anti-miR-NC组，anti-miR-24-3p组MCF-7细胞中RNF2蛋白的表达显著升高（P＜0.05），见图3B及表5。*P＜0.05vsmiR-NCgroup.*P＜0.05vsmiR-NCgroup；#P＜0.05vsanti-miR-NCgroup.

Figure 3.miR-24-3p targeted RNF2 and regulated its expression.A：the 3′UTRof RNF2 contains a nucleotide sequence complementary to miR-24-3p；B：RNF2 protein electropherogram.图3 miR-24-3p靶向调控RNF2的表达

表4 双萤光素酶报告基因实验结果Table 4.The results of dual-luciferase reporter assay（Mean±SD.n=9）

表5 miR-24-3p调控RNF2蛋白的表达Table 5.miR-24-3p regulated the expression of RNF2 protein（Mean±SD.n=9）

5 miR-24-3p过表达对MCF-7细胞增殖和放疗敏感性的影响

相较于miR-NC组，miR-24-3p组MCF-7细胞中miR-24-3p的表达水平显著升高（P＜0.05），且细胞活力的抑制率显著升高（P＜0.05），见表6。集落形成实验后，通过多靶单击模型拟合计算得出，miR-NC组和miR-24-3p组的D0值分别是2.267和1.370，miR-24-3p过表达的SER是1.655，见表7。细胞存活拟合曲线显示，在同一剂量照射下，miR-24-3p组的SF显著小于miR-NC组，存活曲线显著下移（P＜0.05），见图4。

表7 miR-NC组和miR-24-3p组的多靶单击模型参数Table 7.The parameters of multitarget single-hit model in miRNCand miR-24-3p groups

6 抑制miR-24-3p表达逆转了白头翁皂苷A对MCF-7细胞增殖和放疗敏感性的作用

相较于白头翁皂苷A+anti-miR-NC组，白头翁皂苷A+anti-miR-24-3p组MCF-7细胞中miR-24-3p表达水平显著降低（P＜0.05），RNF2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），且细胞活力的抑制率显著降低（P＜0.05），见图5及表8。

Figure 4.Effect of miR-24-3p overexpression on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group.图4 miR-24-3p过表达对MCF-7细胞放射敏感性的影响

Figure 5.RNF2 protein electropherogramof different groups.图5 各组RNF2蛋白电泳图

表8 抑制miR-24-3p表达逆转了白头翁皂苷A对MCF-7细胞活力的作用Table 8.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

集落形成实验后，通过多靶单击模型拟合计算得出，白头翁皂苷A组和白头翁皂苷A+anti-miR-24-3p组的SER分别是1.766和0.603，见表9。细胞存活拟合曲线显示，在同一剂量照射下，白头翁皂苷A+anti-miR-24-3p组的SF大于白头翁皂苷A+antimiR-NC组，存活曲线上移（P＜0.05），见图6。

讨 论

近年来研究表明，中医药可以减轻放化疗带来的毒副反应，且可提高肿瘤细胞的放射敏感性［9］。中药白头翁中提取的有效成分皂苷具有体外抗肿瘤作用［10］，如白头翁皂苷A可以通过调控Bcl-2、cyclin B1等蛋白的表达促进多发性骨髓瘤细胞凋亡［11］。在急性白血病中，白头翁皂苷A可诱导K562细胞向红系分化；还可诱导急性髓系白血病细胞系（K562、U937及HL-60细胞）及其原代细胞向更成熟的粒系分化［12］。白头翁皂苷A可增强人非小细胞肺癌细胞的放射敏感性［5］。白头翁皂苷D通过抑制AKT/mTOR信号通路可抑制结肠癌肿瘤的血管生成，诱导细胞凋亡［13］；而抑制PI3K通过降低AKT活性可提高MCF-7细胞对放射的敏感性［14］。以上结果表明，白头翁皂苷不仅具有抗肿瘤作用，还能增加癌细胞对辐射的敏感性。本实验结果显示，白头翁皂苷A可抑制乳腺癌细胞增殖，且增强了乳腺癌细胞的放射敏感性。与先前研究报道相符。

表9 各组多靶单击模型参数Table 9.The parameters of multitarget single-hit model in different groups

Figure 6.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Pulsatilla saponin A+anti-miR-NCgroup.图6 抑制miR-24-3p表达逆转了白头翁皂苷A对MCF-7细胞放射敏感性的作用

miRNA不仅参与肿瘤细胞的恶性生物学行为，还与细胞放射敏感性相关。miR-24-3p在膀胱癌、结肠癌等多种肿瘤组织中下调表达，过表达可以抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭［15-16］。miR-24-3p通过靶向SOX7促进肺癌中的细胞迁移和增殖［17］。miR-24-3p通过靶向下调PRKCH可抑制腺样囊性癌细胞的活力、增殖、迁移、侵袭等［18］。过表达miR-24通过靶向SP1能增强鼻咽癌的放射敏感性［19］。既往研究表明miR-24-3p在MCF-7细胞中下调表达，促进乳腺癌细胞增殖和侵袭，进而影响乳腺癌预后［7］。本研究表明，过表达miR-24-3p可抑制乳腺癌细胞增殖，与前人研究相符，且过表达miR-24-3p增强了乳腺癌细胞的放射敏感性。

miRNA可通过调控其靶基因发挥多种生物学作用［20-21］。研究显示，RNF2在乳腺癌组织中高表达，是一种癌基因［22］。沉默RNF2可能通过上调Bax以及下调cyclin D2、cyclin依赖性激酶4和Bcl-2诱导细胞周期停滞在G0/G1期并促进细胞凋亡，从而增强食管癌细胞的放射敏感性［23］；下调RNF2还可抑制胶质瘤细胞生长，增强U87细胞对放射的敏感性［24］。本研究表明，miR-24-3p靶向下调RNF2的表达，且白头翁皂苷A促进miR-24-3p的表达，抑制RNF2的表达。这提示白头翁皂苷A可能通过调控miR-24-3p/RNF2影响乳腺癌细胞的增殖及放射敏感性。

综上所述，白头翁皂苷A在体外具有抑制乳腺癌细胞增殖、增强其放射敏感性的作用。这些作用可能是通过上调miR-24-3p、下调RNF2的表达实现的。