防己诺林碱对糖皮质激素诱导雄性骨质疏松大鼠影响的研究

徐志平 卞龙艳 闻纯

江苏医药职业学院基础教研室，江苏 盐城 224005

骨质疏松是一种常见的骨骼疾病，影响全球20多亿人[1]。骨质疏松的特征是骨密度降低，骨强度降低，骨组织结构发生改变[2]。女性绝经后骨质疏松导致骨折风险增加。在中国，40.1%的50岁以上女性患有骨质疏松。骨重建随着成骨细胞骨形成减少和破骨细胞骨吸收增加而改变[3]。骨密度(bone mineral density, BMD)在骨质疏松筛查中用于评估和诊断[4]。骨微观结构的改变和骨密度的降低导致机械强度降低，微型计算机断层扫描(Micro-CT)也被用来诊断骨质疏松[5]。目前已建立了几种骨质疏松动物模型，糖皮质激素诱导的骨质疏松是最常见的骨质疏松模型之一[6]。文献[7]表明，糖皮质激素治疗使骨基质形成减少，骨吸收增加，从而减少了骨细胞和成骨细胞的产生。此外，糖皮质激素可减少成骨细胞的自噬并诱导其凋亡[8]。糖皮质激素通过促进Bcl-2的表达和下调Bcl-xl的表达而引起细胞凋亡[9]。在过去的几十年中，替代医学在治疗包括神经性疾病在内的几种疾病方面显示出了潜力。防己诺林碱是一种生物碱，据报道[10]具有抗炎活性。防己诺林碱还具有很强的自由基清除、降压、抗癌、抗氧化、抗血栓等作用[11]。因此，本研究将探讨防己诺林碱对骨质疏松和骨丢失的保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料

12周龄雄性Wistar大鼠，体重240～280 g，购自上海动物史莱克公司。将动物饲养在湿度(60±5)%和温度(26±2)℃的环境中，具有12 h夜间/白天循环。化学品防己诺林碱购自Sigma Aldrich(CA，USA);TRIzol试剂和cDNA合成试剂盒购自Thermo Fisher Scientific(MA，USA);Lowry蛋白质测定试剂盒购自Bio-Rad Laboratories(CA，USA);抗Bcl-2抗体(1∶400)、抗caspase-3(1∶500)、抗BMP2(1∶800)、抗Beclin-1(1∶600)和抗RANKL(1∶1 000)从Santa Cruz Biotechnology(TX，USA)获得;抗LC3(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶1 500)来自Cell Signaling Technology(MA，USA)。

1.2 方法

1.2.1研究方案：将所有动物分成5个独立研究的组：未治疗的对照组(A组);泼尼松龙治疗组(B组)皮下注射泼尼松龙(2.5 mg/kg);防己诺林碱低剂量组(C组)给予腹腔注射防己诺林碱(1 mg/kg)联合皮下注射泼尼松龙(2.5 mg/kg);防己诺林碱中剂量组(D组)给予腹腔注射防己诺林碱(3 mg/kg)联合皮下注射泼尼松龙(2.5 mg/kg);防己诺林碱高剂量组(E组)给予防己诺林碱(10 mg/kg)联合皮下注射泼尼松龙(2.5 mg/kg)。治疗1个月后评估防己诺林碱对骨质疏松症的影响。

1.2.2检测指标评估：在治疗方案结束时，分离大鼠双侧股骨并在室温下用1%甲醛固定过夜，然后在室温下浸入70%乙醇中2 h。使用微型CT仪器SCANCO图像处理语言软件。使用双能X线DCS-600 Aloka骨密度仪测量分离骨样品的BMD。将动物麻醉后收集血液进行生化参数的评估，2 000 r/min, 离心10 min分离血清。根据制造商的说明，使用自动分析仪在血清中测定碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性以及磷和钙的浓度。ELISA试剂盒用于测定I型片段胶原(CTX)和骨钙蛋白(OC)蛋白的血清浓度。

1.2.3反转录聚合酶链反应(RT-PCR)：在治疗方案结束时，从所有动物中分离胫骨组织，并按照制造商给出的说明使用TRIzol试剂提取总RNA。根据cDNA合成试剂盒制造商的说明，从RNA反转录cDNA。使用StepOne实时PCR系统进行定量PCR，并将GAPDH用作内部对照。通过在95 ℃热循环10 min进行PCR，然后在95 ℃、45 ℃、60 ℃下进行40个循环15 s，最后延伸步骤95 ℃15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。使用的引物是核因子-κB配体(RANKL)、自噬蛋白(ATG)5、Runt相关转录因子(RUNX)2、Beclin-1、骨形态发生蛋白2(BMP2)和GAPDH的受体激活剂。比较Cq方法用于测定相对基因表达，GAPDH用作内部对照。

1.3 统计学处理

所有数据均表示为均数±标准差。使用单向ANOVA进行统计分析。 通过Dunnett的事后检验(GraphPad Prism 6.1，CA，USA)进行多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 防己诺林碱对微结构参数和BMD的影响

显微CT分析显示出防己诺林碱对泼尼松龙诱导的骨质疏松大鼠股骨干骺端的骨损失影响(图1、表1)。与对照组相比，在泼尼松龙组中发现的微结构参数如骨表面密度、小梁骨组织体积密度、小梁数和小梁数厚度显著降低(P<0.05，P<0.01)。然而，用防己诺林碱治疗显著减弱了泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠股骨干骺端微结构参数的改变。泼尼松龙组的骨密度[(0.128±0.007) g/cm3]显著低于对照组[(0.297±0.013)g/cm3)]。与泼尼松龙组相比，防己诺林碱治疗组的BMD显著增加至(0.273±0.017) g/cm3。

2.2 防己诺林碱对大鼠血清生化参数的影响

本研究进一步评估了防己诺林碱对泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠血清生化指标的影响，如图2所示。与对照组相比，泼尼松龙组大鼠血清中

图1 防己诺林碱对泼尼松龙所致骨质疏松大鼠股骨三维重建显微CT图像的影响 A：对照组;B：泼尼松龙治疗组;C：防己诺林碱低剂量组;D：防己诺林碱中剂量组;E：防己诺林碱高剂量组。Fig.1 Assessment of the effect of fangchinoline on 3D-reconstructed micro-CT images of the femur of the prednisolone-induced osteoporosis rats

组别骨表面小梁密度/mm-1骨小梁体积骨密度/%小梁数目/mm-1小梁厚度/mm骨密度/(g/cm3)A组3.92±0.4237.21±2.971.42±0.0360.279±0.0410.297±0.013B组2.36±0.28##22.49±1.42##0.83±0.028##0.246±0.017#0.128±0.007##C组2.61±0.3326.33±1.690.94±0.0190.258±0.0230.163±0.004*D组3.17±0.29**32.84±2.16**1.27±0.023**0.264±0.014*0.236±0.011**E组3.72±0.32**36.42±2.46**1.58±0.031**0.283±0.031*0.273±0.017**

注：与对照组相比，#P<0.01; 与泼尼松龙组相比，*P<0.05，*P<0.01。

图2 防己诺林碱对泼尼松龙所致骨质疏松大鼠血清生化指标的影响 A：对照组;B：泼尼松龙治疗组;C：防己诺林碱低剂量组;D：防己诺林碱中剂量组;E：防己诺林碱高剂量组。注：与对照组相比，#P<0.01; 与泼尼松龙组相比，*P<0.05，*P<0.01。Fig.2 Assessment of the effect of fangchinoline on biochemical parameters in the serum of prednisolone-induced osteoporosis rat model

ALP和TRAP活性以及Ca、P和CTX水平显著增加(P<0.01)。此外，与对照组相比，泼尼松龙组大鼠血清中OC水平显著降低(P<0.01)。用防己诺林碱治疗改变了泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠血清中的生化参数，例如ALP和TRAP的活性以及Ca、P、OC和CTX的水平。

2.3 防己诺林碱对RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1基因表达的影响

防己诺林碱对RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1基因表达的影响如图3所示。泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠股骨组织中BMP2的水平较对照组显著降低(P<0.01)。与对照组相比，泼尼松龙组股骨组织中ATG-5、RUNX-2和Beclin-1的基因表达显著降低并且RANKL的表达显著增强(P<0.01)。然而，与泼尼松龙组相比，用防己诺林碱治疗的C、D和E组显著增强了ATG-5、RUNX-2、Beclin-1和BMP2的基因表达，并且股骨组织中RANKL的表达显著降低(P<0.01)；且上述疗效以剂量依赖的方式出现。

图3 防己诺林碱对泼尼松龙所致骨质疏松大鼠股骨组织RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1、BMP2基因表达的影响 A：对照组;B：泼尼松龙治疗组;C：防己诺林碱低剂量组;D：防己诺林碱中剂量组;E：防己诺林碱高剂量组。注：与对照组相比，#P<0.01; 与泼尼松龙组相比，*P<0.05，*P<0.01。Fig.3 Assessment of the effect of fangchinoline on gene expression of RANKL, ATG-5, RUNX-2, Beclin-1 and BMP2 in the femur tissues of prednisolone-induced osteoporosis rat model

3 讨论

之前的一项研究[12]表明，泼尼松龙诱导的骨质疏松症是一种成熟的骨质疏松症大鼠模型，因为血清中的生化参数水平发生了改变，BMD降低。本次研究结果表明防己诺林碱治疗显著减弱了血清中生化参数的改变水平，并且还改善了泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠股骨BMD。据报道[13]，泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠中，骨的微结构也发生了改变，从而降低了骨强度。使用防己诺林碱治疗会影响泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠股骨干骺端中微观结构的改变。

文献[14]显示，成骨细胞分泌BMP2，调节成骨细胞的矿化和增殖。 此外据报道[15]，通过RANK的表达和RUNX-2的表达激活破骨细胞，与骨质疏松症有关。本次研究表明，使用防己诺林碱治疗可以剂量依赖性地减弱泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠股骨干骺端骨组织中BMP-2、RANKL和RUNX-2蛋白的表达。自噬也是骨质疏松症发展的机制之一，据报道[16]，一些蛋白质如ATG-5和Beclin-1是自噬体的调节蛋白，并且使用防己诺林碱治疗改变了这几种蛋白质的水平，如ATG-5和Beclin-1，以剂量依赖的方式在泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠股骨组织中表达。

综上，防己诺林碱可通过诱导自噬来抑制成骨细胞的凋亡并防止泼尼松龙诱导的骨质疏松症大鼠骨质流失，其对骨质疏松症具有很强的活性，可能是一种很有意义的临床研究分子。