牛结核病污染场4 种检测方法评估

张建东，陈永林，马宏伟，刘天驹，张 涛，李 钊，赵建东，米吉提·莫合他尔汗，颜成旭，路广计，张喜悦

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2.洛阳市动物疫病预防控制中心，河南洛阳 471000；3.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄 050000；4.石家庄市动物疫病预防控住中心，河北石家庄 050000；5.济源市动物疫病控制中心，河南济源 459000；6.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830000；7.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

牛结核病（bovine tuberculosis，bTB）是由分枝杆菌属牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）引起的一种人兽共患慢性消耗性传染性疾病，给我国养牛业带来严重危害[1]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛分枝杆菌感染宿主广泛，除可感染人外，还可感染50 多种哺乳动物[2]。牛结核病目前尚无有效疫苗预防，药物治疗成本太高，所以“检测+扑杀”是控制该疫病的主要手段。

我国目前的牛结核病检测方法主要包括，结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态反应试验（SICTT）、γ-干扰素ELISA试验（IFN-γ-ELISA）、抗体ELISA 试验和胶体金检测等[3]。TST 是我国牛结核病检测的国家标准，也是国际贸易指定方法。此方法灵敏度高，但特异性差，无法排除其他结核杆菌干扰。SICTT 与TST相比，可排除其他杆菌干扰，减少假阳性。TST 和SICTT 检测成本低，但操作麻烦、耗时长，结果判定主观性强[4]。IFN-γ-ELISA 试验操作简单，但成本较高[5]。抗体ELISA是现代抗体检测的主要方法，但牛分枝杆菌抗原表位复杂，不同阶段可产生不同抗体，因而导致检测阳性率偏低[6]。

结核病污染场内，牛分枝杆菌普遍存在，需要敏感性更高的检测方法，来尽量避免漏检，从而加快净化进程。本试验采用TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗体ELISA 4 种检测方法，同时对牛结核病污染场的牛群进行检测，比较分析不同试验的检测结果，以期为我国牛结核病污染场的净化提供有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 牛PPD、禽PPD、INF-γ 夹心ELISA 检测试剂盒（批次P201906-001），均购自青岛瑞尔公司；牛分枝杆菌ELISA 抗体检测试剂盒（批号190504），购自韩国安世佳合有限责任公司。仪器包括：剪毛剪、0.5 mL 注射器、游标卡尺、酶标仪（包含450 nm 和620～650 nm 滤光片）、CO2培养箱、12 孔细胞培养板、肝素钠采血管、移液器及吸头等。

1.1.2 试验动物 某规模养殖场的300头泌乳牛。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

1.2.1.1 TST 试验 按照国家标准《动物结核病诊断技术》（GB/T 18645—2002）的要求操作和结果判定：采用牛型PPD，剂量为2 000 IU，分别于注射前和注射后72 h 测量皮肤厚度，并计算皮厚差。皮厚差≥4.0 mm，为阳性；2.0 mm ≤皮厚差＜4.0 mm，为疑似；皮厚差＜2.0 mm，为阴性。疑似牛于第1 次检疫 60 d 后进行复检，仍为疑似时，60 d 后再复检，如仍为疑似，则判为阳性。

1.2.1.2 SICTT 试验 采用牛PPD 和禽PPD，在牛颈部左侧分点皮内注射，注射点间隔12～15 cm，72 h 后，观察注射部位的炎性反应，并量取皮皱厚，根据皮皱厚增加值判定。牛型PPD 皮厚差减去禽型PPD 皮厚差＞4 mm，判为阳性；1 mm ＜牛型PPD 皮厚差减去禽型PPD 皮厚差≤4 mm，判为可疑；牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD 皮厚差，判为阴性。

1.2.1.3 IFN-γ-ELISA 试验 采集5 mL 血液肝素抗凝血液，各取1.5 mL 加入3 个孔中，然后分别取100 μL 的牛型PPD、禽型PPD 和阴性对照磷酸盐缓冲液（PBS），加入抗凝全血中，混匀后放于含5% CO2的培养箱中37 ℃培养18 h。用移液器小心吸取培养上清，转入1.5 mL 离心管中，即获得刺激产生的γ-干扰素上清。取出单抗包被板，每孔加入50 μL 样品稀释液，然后加入50 μL 待测样品或对照，混匀后室温作用1 h；洗涤，每孔加入100 μL 酶标抗体，室温作用1 h；洗涤后每孔加入100 μL 底物，室温避光作用30 min 后，加入终止液，测定OD450nm值。当牛型PPD 刺激上清的OD 值-PBS 刺激上清的OD 值≥0.1，且牛型PPD 刺激上清OD 值-禽型PPD 刺激上清OD值≥0.1，为阳性，反之为阴性。

1.2.1.4 抗体ELISA 试验 按照牛分枝杆菌ELISA 抗体检测试剂盒操作步骤进行，计算S/P值。S/P=（样品OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值）/（阳性对照OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值）。S/P≥0.3 为阳性，S/P＜0.3为阴性。

1.2.2 评估方法 以TST 试验为参考标准，分别与SICTT、IFN-γ-ELISA、抗体ELISA 检测结果比较，计算符合率，并运用SPSS 软件进行对比，分析敏感性差异。

2 结果与分析

2.1 TST 与IFN-γ-ELISA

对比结果（表1）显示：TST 检出阳性114 份，IFN-γ-ELISA 检出阳性154 份，符合率为72.7%，经SPSS 分析，P＜0.05，说明IFN-γ-ELISA 阳性检出率显著高于TST，表明其敏感性明显高于TST。

表1 TST 与IFN-γ-ELISA 检测结果对比 单位：份

2.2 TST 与SICTT

对比结果（表2）显示：TST 检出阳性114份，SICTT 检出阳性103 份，符合率为96.3%，经SPSS 分析，P＞0.05，说明SICTT 阳性检出率略低于TST，但差异不显著，表明两种方法的敏感性相似。

表2 TST 与SICTT 检测结果对比 单位：份

2.3 TST 与抗体ELISA

对比结果（表3）显示：TST 检出阳性114 份，抗体ELISA 检出阳性21 份，符合率为69.0%，经SPSS 分析，P＜0.05，说明抗体ELISA 阳性检出率显著低于TST，表明其敏感性明显低于TST。

表3 TST 与抗体ELISA 检测结果对比 单位：份

3 讨论

近年来，我国牛结核病流行率普遍升高，结核病污染场数量逐渐增加[7]。本试验利用4 种检测方法，对结核病污染场的奶牛进行检测。以TST为参考标准，分别与其他3 种方法进行比较，结果发现IFN-γ-ELISA 敏感性最高，明显大于TST，而其他2 种方法的敏感性都低于TST。在牛结核病污染场的净化过程中，要将所有感染牛尽可能全部筛检出来，这就需要敏感性高的检测方法，因此IFN-γ-ELISA 是首选的检测方法。

TST 试验是国家标准，也是国际贸易指定方法，但其结果判定存在人为误差，尤其是大量检测时，会出现阳性漏检。在牛结核病污染场的净化初期，需要进行大量检测，如果采用TST 检测，就会漏检感染牛，使其继续污染牛群[8-9]。SICTT 虽然可排除禽结核杆菌的干扰，检测结果准确，但其阳性检出率更低，同样不适合牛结核病污染场初期的净化。抗体ELISA 检测是现代血清检测的主要方法，操作简单、耗时少，但因不同感染阶段的牛分支杆菌抗体比较复杂，无法准确捕获[10]，导致阳性检出率也明显比TST 偏低，因此也不适合用于牛结核病污染场初期的净化检测。

TST 和SICTT 这两种方法适合在基层推广，成本低，但主观性强，检测过程对牛的应激影响较大[11]。抗体ELISA 检测时间短，出结果快，但成本较高，阳性检出率偏低[12]。IFN-γ-ELISA 操作复杂、成本高，检测要求较高，不适合在基层推广，但检测敏感性高[13]。因此，在实际的牛结核病检测中，应根据不同的需要和条件，选择合适的检测方法，也可以不同方法联合使用。在条件不允许情况下，可以用TST 对牛结核病污染场进行检测。因IFN-γ-ELISA 是4 个方法中最敏感的方法[14]，所以在条件允许的情况下，在牛结核病污染场最适合选用，这样可以尽量避免漏检感染牛。在牛结核病污染场，患结核病的牛数量较多，如果检测方法不敏感，就会导致大量阳性牛漏检，使牛群净化困难[15]。如果每年春秋两季，对牛场进行IFN-γ-ELISA 检测，及时隔离淘汰阳性牛，连续检测几年，牛场就会达到净化目标[16]。

4 结论

评估认为，在TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗体ELISA 4 种检测方法中，IFN-γ-ELISA 方法敏感性最高，阳性检出率最高，可以尽可能地将感染牛全部检出，减少漏检，因此最适合用于牛结核病污染场初期的净化。