2017—2018 年山东省奶牛场犊牛腹泻相关病毒病原学检测

张 亮，张云飞，蒋仁新，任亚初，张 淼，3，楚会萌，解晓莉，程凯慧，杨 美，王基隆，孙阳阳，杨宏军

（1.山东省农业科学院奶牛研究中心，山东济南 250100；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；3.江苏农林职业技术学院，江苏镇江 212400）

犊牛腹泻是犊牛饲养过程中的常见疾病之一，通常会引起犊牛脱水、酸中毒、电解质失衡，导致牛只出现精神萎靡、食欲不振，排水样便、稀便或者软便，以及呕吐、脱水、体重减少等临床症状，一年四季均可发生，但高发于寒冷的冬季及早春季节[1]。犊牛腹泻可使犊牛死亡、发育不良以及治疗费用增加，严重影响奶牛养殖的健康和可持续发展[2]。目前，全世界奶牛场的犊牛腹泻发病率在20%～100%之间不等。根据是否有病原引起，可将腹泻分成非传染性腹泻和传染性腹泻[3]。其中病毒是导致犊牛传染性腹泻的重要原因之一，常见的有牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV），牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV），牛肠道病毒（bovine enterovirus，BEV）和牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）等[4]。

BVDV 可引起以黏膜发炎、糜烂、坏死以及腹泻为特征的急性热性牛传染病，呈世界性分布，广泛存在于欧美等养牛发达国家[5]。BEV 感染性不明显，通常只引起牛的轻度腹泻或隐性感染，但常因侵犯其他器官而引起各种临床综合征，或在一定条件下引发显著症状[6]。BCoV 可引起新生犊牛出血性腹泻和呼吸道感染以及成年牛冬季血痢，遍布全世界[7]。BRV 可引起以精神沉郁、厌食、腹泻、脱水为主要特征的犊牛急性胃肠传染病，在世界范围内造成严重经济损失[8]。目前关于山东省犊奶牛4 种病原调查的报道较少。本研究对山东省犊奶牛群进行上述4 种病毒的病原学检测，以期为了解山东省奶牛消化道疾病病毒性病原的流行状况以及犊牛腹泻的防控和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2017—2018 年，从山东省13 个地级市的51家奶牛场收捡犊牛腹泻粪便样品624 份（表1）。其中：对来自46 家牧场的535 份样品进行BVDV检测，36 家牧场的314 份样品进行BEV 检测，42家牧场的362 份样品进行BCoV 检测，30 家牧场的209 份样品进行BRV 检测。

表1 犊牛腹泻样品来源分布

1.2 主要试剂

AMV 反转录试剂盒，购自Vazyme 公司；rTaqDNA 聚合酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 试剂盒，购自TaKaRa 公司；引物，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 样品采集与核酸提取

用无菌棉拭子采集犊牛新鲜腹泻粪样，放入含2 mL 无菌生理盐水的管中，冷冻后加冰块保温寄送至实验室。将样品充分混匀，反复冻融3 次后，取1 mL，12 000 r/min 离心5 min，取上清，备用。

1.4 PCR 检测

按照TaKaRa 公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 试剂盒说明，从上清中提取病毒核酸样品。将提取后的核酸样品，参照Vazyme公司的AMV 反转录试剂盒说明书制备cDNA，用于后续PCR 检测。分别参照文献[9-12]，设计BVDV、BEV、BCoV 和BRV 检测引物，交由上海生工有限公司合成。采用Vazyme 公司AMV 反转录试剂盒，对样品核酸反转录后进行PCR 扩增。扩增产物通过凝胶电泳仪，检测是否存在目的条带，进而判定样品是否为阳性。

1.5 统计分析

将13 个地级市分为鲁西北（德州、聊城、滨州、东营）、鲁中（济南、泰安、淄博、潍坊）、鲁西南（济宁、临沂、日照）和半岛（青岛、烟台）4个地理区域。对检测结果采用SPSS 20.0 进行数据统计，Pearson 卡方检验进行显著性差异分析，采用Graphpad Prism 8 软件作图。

2 结果与分析

2.1 病原检出率

采用特异性PCR 对BVDV、BRV、BEV和BCoV 进行检测。结果（图1～2）显示：BVDV、BEV、BCoV、BRV 个体检出率分别为34.58%（185/535）、11.78%（37/314）、8.84%（32/362）、17.70%（37/209），群体检出率分别为47.83%（22/46）、38.89%（14/36）、35.71%（15/42）、33.33%（10/30）。BVDV个体检出率和群体检出率均显著高于其他3 种病毒（P＜0.01）。

图1 检测样品中4 种病毒的个体检出率对比

图2 检测样品中4 种病毒的群体检出率对比

2.2 区域分布

对4 种病毒的检测结果，按照山东省地理区域进行统计分析。结果（表1）显示，鲁中地区BVDV 个体检出率为46.08%，显著高于其他区域（P＜0.01），而其他3 个区域间的BVDV 个体检出率以及其他病毒检出率在全省不同地域的分布无明显差异（P＞0.05）。

表2 山东省不同区域4 种病毒的个体检出率统计 %

2.3 时间分布

对2017—2018 年样品检测结果进行统计和对比分析。结果（图3）显示：2018 年BVDV 检出率较2017 年显著增加（P＜0.01），其他病毒略有下降，但下降幅度不显著（P＞0.05）。

图3 2017—2018 年山东省4 种病毒检出率对比

3 讨论

本次检测数据显示，山东省奶牛养殖场犊牛腹泻样品中，BVDV 的个体检出率（34.58%）和群体检出率（47.83%）显著高于其他病原，而且与2017 年相比显著增加，表明BVDV 是导致山东省犊牛腹泻的主要病毒性因素，且有流行加重趋势，建议重点加强防控。

本次检测的BVDV 检出率高于Deng 等[14]2015年报道的32.06%的全国奶牛阳性率和孙力等[15]报道的24.6%的新疆地区阳性率，但低于宋维彪等[16]报道的51.59%的青海省牦牛阳性率。目前国内多数牧场未对进出场的牛只进行BVDV 检测，且BVDV 疫苗免疫率较低，从而导致了BVDV 在牧场间或牧场内的传播和流行[7]。在牛只转运时无需检测BVDV 以及BVDV 疫苗免疫率低的背景下，山东省较全国其他省份BVDV 流行严重可能与山东省奶牛集约化养殖程度高、流动性大相关。

要控制BVDV 的区域流行和传播，牧场可根据自身情况和经济承受能力，开展BVDV 防控和净化工作。对于低阳性率牧场，淘汰阳性牛和群体监控是牧场安全的有力保障；对于高阳性率或进出场牛只频繁的牧场，可通过疫苗免疫、分群饲养、监测新生犊牛和进场牛、淘汰持续感染（PI）牛等综合措施逐步开展净化。在BVDV 高发季节、高阳性率牧场，开展犊牛舍消毒、进出场消毒和初乳巴氏消毒等有效的消毒措施，可有效降低BVDV的传播风险。

4 种腹泻相关病毒性病原引起的腹泻是严重影响犊牛发育和成活率的主要疾病之一，目前尚无特效治疗方法。国内仅有BVDV 灭活疫苗，一般只用于本病流行地区2 月龄至2 岁牛的免疫，对育成母牛和种公牛可于配种前再接种1 次，这样多数牛可以获得免疫[13]。对于其他3 种病毒，目前尚无成品疫苗使用，感染发病时可应用收敛剂和补液等进行保守治疗，同时配合抗生素治疗[17]。平时应该加强检疫，对引进牛只严格进行血清学检测，防止引入带毒牛。一旦发生腹泻，对病牛进行隔离治疗或处理。4 种病原引发疾病的预防关键在于加强饲养管理。新生犊牛及时喂服初乳、降低圈内地面冷辐射和加强圈舍消毒，可有效降低犊牛腹泻发生率。另外，国内科研工作者应加快新流行毒株的分离，筛选出免疫原性好的毒株进行疫苗研制，通过疫苗免疫来更好地预防BVDV、BCoV 等感染的发生。

本次检测涉及的样品均来自牧场送检的犊牛腹泻粪便样品，仅对BVDV、BEV、BCoV 和BRV 进行了检测分析，并未检测细菌及其他病毒的感染情况，也没有对所有样品全部检测4 种病原，无法分析样品中病原的混合感染情况，因此无法明确引起犊牛腹泻的具体病因，检测结果也不能真实反映这些病原的流行情况，但可以说明这些病原是引起犊牛腹泻的重要影响因素，应引起重视。

4 结论

检测表明，4 种腹泻相关病原在山东省内奶牛群中流行广泛，以BVDV 流行最为严重，尤其是鲁中地区，且有流行加重趋势，建议有针对性地开展防控与净化工作。