小反刍兽疫竞争、间接和阻断ELISA免疫抗体检测方法的对比和应用

邢作志，张 雁

(1 甘州区畜牧兽医工作站，甘肃 张掖 734000；2 张掖市农业综合行政执法队，甘肃 张掖 734000)

小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起山羊和绵羊的一种急性接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。本病以发病率高和死亡率高为特点，严重威胁着畜牧业的发展。本次试验主要应用竞争ELISA、间接ELISA和阻断ELISA三种免疫抗体检测方法检测小反刍兽疫病毒的免疫抗体，以此评价小反刍兽疫疫苗的免疫效果。

1 试验材料

1.1 检测样品

血清样品采集自甘州区辖区内经小反刍兽疫活疫苗免疫的羊，要求清亮且无溶血。

1.2 试验器材

RT-6100酶标仪、37 ℃恒温箱、500 mL量筒、纯水仪、5 μL～50 μL单道移液器、10 μL～100 μL多道移液器、50 μL～300 μL多道移液器、配套移液枪头、加液槽和96孔抗原抗体反应板均为试验常用仪器，小反刍兽疫竞争ELISA抗体检测试剂盒、间接ELISA抗体检测试剂盒和阻断ELISA抗体检测试剂盒分别购自中国农业科学院兰州兽医研究所、深圳真瑞生物科技有限公司和青岛立见诊断技术发展中心。

2 试验方法

2.1 竞争ELISA抗体检测

2.1.1 加样

依次加入以下试剂及样品：① 待检血清，每份血清必须做两个重复孔，每孔加入待检血清样品50 μL；②对照，每块酶标板上均应设标准阴性血清、阳性血清、单克隆抗体及空白对照孔，其中标准阴性血清应设2孔，标准阳性血清应设2孔，每孔加入相应血清50 μL，空白对照设2孔，每孔加入100 μL血清稀释液，单克隆抗体对照设4孔，每孔加入50 μL血清稀释液；③加单抗，将单克隆抗体用血清稀释液进行1∶100倍稀释，除空白对照孔外其他各孔每孔加50 μL稀释后的单克隆抗体。

小反刍兽疫竞争ELISA抗体检测样品布板情况见图1。

2.1.2 孵育

完成加样后，将酶标板置于微量振荡器上振荡混匀，随后置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。

2.1.3 洗酶标板加酶结合物

取出酶标板甩干，用洗涤液(1×PBST)洗涤3次，在吸水纸上拍干，用血清稀释液按1∶100稀释兔抗鼠IgG-HRP结合物，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。

2.1.4 洗酶标板加底物溶液

取出酶标板甩干，用洗涤液(1×PBST)洗涤3次，在吸水纸上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，置37 ℃避光静置显色反应 10 min～ 15 min。

2.1.5 加终止液并读数

显色反应结束后，每孔加入终止液50 μL，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。

2.1.6 结果判定

根据公式：PI＝[1-(样品孔的OD450nm值/单抗对照孔OD450nm值)]×100%进行判定。

判定标准：① 当阴性对照孔PI＜40%，阳性对照孔PI＞60%时检测结果成立，否则该次检测结果无效；②样品血清PI≥45%，抗体阳性，PI＜40%，抗体阴性，40%≤PI＜45%，则判定为可疑。

2.2 间接ELISA抗体检测

小反刍兽疫间接ELISA抗体检测样品布板情况见图2。

⑴ 血清稀释：在血清稀释板中按1∶100的体积比稀释待检血清，每个样品在加入包被板前应充分混匀。

⑵ 将稀释好的待检血清加入包被好的酶标板中，每孔100 μL，同时设阴性对照1孔和阳性对照2孔，每孔加入相应的血清100 μL，盖上封板膜，置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶标板甩干，用工作浓度洗涤液洗涤4～6次，在吸水纸上拍干，每孔加入50 μL酶结合物，然后置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。

⑷ 取出酶标板甩干，用工作浓度洗涤液洗涤4～6次，在吸水纸上拍干，每孔加入100 μL显色液，置37 ℃避光静置显色反应10 min。

⑸ 显色反应结束后，每孔加入50 μL终止液，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。

⑹ 结果判定：阴性对照的OD450nm值＜0.2，阳性对照的OD450nm值＞0.4时试验成立；样品OD450nm值/阳性对照的OD450nm均值＝S/P值，S/P值 ≥ 0.3判为阳性，S/P值＜0.3判为阴性。

2.3 阻断ELISA抗体检测

小反刍兽疫阻断ELISA抗体检测样品布板情况见图3。

⑴ 在阴性对照孔和阳性对照孔中加入相应的血清，每孔50 μL，在酶标单抗对照孔中加入50 μL稀释液。在每个样品孔中加入25 μL稀释液，再加入25 μL待检血清，然后置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。

⑵ 取出酶标板甩干，用洗涤液(用超纯水做20倍稀释，按5‰比例加入吐温-20)(1×)洗涤4次，在吸水纸上拍干，用血清稀释液按5倍稀释酶标单抗，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶标板甩干，用洗涤液(1×)洗涤4次，在吸水纸上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，室温避光静置显色反应10 min～ 15 min。

⑷ 显色反应结束后，每孔加入50 μL终止液，终止反应。在酶标仪上读取OD450nm值，计算阻断率。阻断率(PB)计算方法：PB＝100-[待检血清OD450nm值(或对照OD450nm平均值)]×100%/Cm的 OD450nm平均值。

⑸ 对结果进行判定。阳性对照的阻断率(PB)＞60，阴性对照的阻断率(PB)＜40，试验结果有效；待检样品阻断率(PB)＞50判为阳性，待检样品阻断率(PB)≤50判为阴性。

3 结果与讨论

⑴ 竞争ELISA、间接ELISA和阻断ELISA三种免疫抗体检测方法都可对小反刍兽疫病毒免疫抗体进行检测，在同一块96孔酶标板中，竞争ELISA、间接ELISA和阻断ELISA可以分别检测43份、93份和90份样品，但是竞争ELISA和间接ELISA的操作相对比较复杂，且用时较多；阻断ELISA的操作简单，用时少。如果同时检测100份样品，竞争ELISA、间接ELISA和阻断ELISA的准确率分别为85%、88%和95%，因此阻断ELISA的准确度和重复性均高于其他两种检测方法，是小反刍兽疫病毒免疫抗体检测的首选检测方法。

⑵ 小反刍兽疫对反刍动物的危害大，发病率和病死率通常分别超过60%和50%，该病最有效的防控手段是给动物接种小反刍兽疫疫苗，因此，小反刍兽疫病毒免疫抗体是评价羊场安全及经济效益的最理想的指标，选择正确的抗体检测方法也是重中之重。