基于便携式表面增强拉曼光谱仪检测血红蛋白

任肖锋, 郑大威, 王惠琴*, 张 萍, 林太凤, 卫晓丹

(北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124)

血红蛋白(Hb)是红细胞的主要成分，为一种由4个亚基组成以血红素为辅基的结合蛋白,是动物及人体内执行输氧任务的蛋白质[1]。其中，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子包在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白，对可逆氧的携带和储存起着重要作用。许多疾病的发生与血红蛋白有关，如地中海贫血、镰状细胞病和肺气肿[2，3]。因此，检测血红蛋白是很重要的。为了精确测量血红蛋白，比色法、化学发光法、电化学法、胶体金免疫法、匹拉米洞化学法、双配体金纳米簇修饰法等[4 - 9]已被报道。然而，许多缺点限制了它们的应用，包括它们需要精密的仪器，昂贵的材料，抗体作为受体，或者需要复杂的样品制备过程，测试时间长、成本高等，不利于快速筛查。

表面增强拉曼技术是近些年发展起来的一种新型检测技术，是基于表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)的原理，将吸附在粗糙化或金属纳米粒子表面的被测物的拉曼散射信号极大增强的光学效应。由于其具有较高的检测灵敏度，并能给出丰富的分子结构信息，被广泛应用于分析化学、表面科学以及生物医学等众多领域。本研究利用了便携式拉曼光谱仪，采用SERS方法，研究了血红蛋白的SERS特征图谱。与传统检测方法相比，本研究所采用的SERS测定蛋白质的方法不需要探针标记，且无需复杂的前处理方法以及专业的操作人员进行操作，能够在几分钟内进行检测，为快速、实时、高效的检测蛋白质奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

RamTracer-200便携式拉曼光谱仪(欧普图斯光纳科技有限公司)；inVia共聚焦显微拉曼光谱仪(Renishaw公司)；KQ-500DB超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

血红蛋白标样(生工生物工程(上海)有限公司)；柠檬酸钠(Alfa Aesar公司)；HAuCl4(分析纯，Sinopharm公司)；乙腈(Fisher Scientific公司)；无菌离心管(无锡耐思生物技术有限公司)。实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米Au溶胶的制备根据Lee等[10]的方法，将50 mL的0.01% HAuCl4溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加适量的1%柠檬酸钠溶液，继续煮沸约30 min，待反应溶液颜色变为澄清的酒红色，降温冷却，即得到纳米Au溶胶[11]。

1.2.2 样品溶液配制将血红蛋白粉末用超纯水进行溶解，按照梯度稀释的方式配制成30、25、20、10、5、3、1 mg/L 7个系列浓度的血红蛋白溶液进行测定。

1.2.3 表面增强拉曼光谱采集条件inVia共聚焦显微拉曼光谱仪的检测条件：将血红蛋白粉末样品置于载玻片上，置于显微镜载物台上直接测量，50倍长焦物镜，785 nm激光光源波长，测定方式是单次光谱采集。初始检测条件：积分时间为20 s，积分次数为3次，扫描范围100～3 000 cm-1，功率2.5 mW。每一种待测样品分别进行多点采集取平均值。RamTracer-200便携型拉曼光谱检测仪(45 cm×30 cm×20 cm)，激光波长为785 nm，分辨率为1 cm-1，扫描范围为250～2 300 cm-1。初始检测条件：激光功率为250 mW，积分时间设为20 s，积分次数为3次，平滑系数为1。在每次测定之前，需要通过乙腈来校正X轴的拉曼位移。每一种待测样品分别进行不少于5次的重复检测。

1.2.4 图谱预处理与数据分析SERS检测得到的原始谱图需经过基线校正和平滑降噪两个步骤完成预处理。除光谱仪自身配套软件RamanAnalyzerV485LCREV1提供的基线校正功能，可以对原始图谱进行一个初步处理，此外还采用Origin8.0等图像处理软件对数字化的谱图进行平滑降噪。

2 结果与讨论

2.1 便携式拉曼光谱仪测定血红蛋白

2.1.1 Au溶胶对血红蛋白拉曼信号增强效果对比图图1表明，使用纳米Au溶胶作为增强试剂对血红蛋白进行测定时，血红蛋白的SERS信号会有明显增强，这是因为当血红蛋白与纳米Au溶胶混合时，血红蛋白会吸附到Au颗粒表面，使其拉曼信号得到显著增强。

2.1.2 不同粒径Au溶胶对血红蛋白SERS的影响图2显示粒径为50±15 nm的纳米Au溶胶峰强比最高，为I1531/I1438=3.38，对血红蛋白的增强效果最好。粒径为50±15 nm、100±15 nm的纳米Au溶胶对血红蛋白的SERS信号相对较强，且在1 531 cm-1处峰强明显升高。这是因为当金属溶胶粒径较大时，理论上能够吸附更多的血红蛋白分子，有利于血红蛋白分子吸附在其上形成较好的单分子吸附层，形成强烈的表面等离子体共振[12]。而粒径为20±15 nm 纳米Au溶胶对血红蛋白表面增强拉曼信号几乎没有增强效果。这可能是因为Au纳米颗粒粒径较小，血红蛋白吸附于纳米颗粒上时形成聚集体较小，金属纳米表面等离子体共振小，所以几乎没有SERS信号[13]。

图1 血红蛋白SERS谱图Fig.1 Surface-Enhanced Raman spectra of Hemoglobin

图2 5 mg/L的血红蛋白用不同粒径纳米Au溶胶增强后的效果Fig.2 Effect of 5 mg/L hemoglobin enhanced with nanogold sol with different particle sizes

2.1.3 不同浓度血红蛋白的SERS光谱不同浓度的血红蛋白与纳米Au溶胶的结合后呈现出不同的增强效果，浓度为5～30 mg/L的纳米Au溶胶加入血红蛋白颜色会发生明显变化，且5～20 mg/L的纳米Au溶胶与血红蛋白结合效果较好(图3)。通过图4可以看出，当血红蛋白浓度在5～30 mg/L的范围内，在I1531处的拉曼强度具有良好的线性关系，且误差较小。

图3 不同浓度的血红蛋白在50±15nm粒径纳米Au溶胶下的增强效果图Fig.3 Enhancement effect of different concentrations of hemoglobin under with particle size of 50±15 nm nanogold sol

图4 1 531 cm-1处SERS峰谱强度与血红蛋白浓度的线性回归方程Fig.4 Linear regression equation for SERS peak intensity and hemoglobin concentration at 1 531 cm-1

图5 SERS检测血红蛋白的重现性Fig.5 Reproducibility of hemoglobin detection by SERS

2.1.4 方法的重现性图5中，对浓度为5 mg/L、不同批次的血红蛋白溶液与400 μL的纳米Au溶胶结合进行SERS测定，结果显示，该方法具有较好的重现性。

2.2 共聚焦显微拉曼光谱仪测定血红蛋白

由图6可以看出，血红蛋白固体标样的主要特征峰为1 003、1 114、1 246、1 446、1 578 cm-1，血红蛋白液体样品仅有1 278、1 553 cm-1两个特征峰。通过增强后的血红蛋白溶液的SERS谱图可以发现，其主要特征峰为1 002、1 244、1 444、1 538 cm-1。峰强度的增强可能是由于贵金属纳米颗粒尖端或间隙中的电磁场受到激光激发，发生共振耦合，电磁场强度得到局部增强，纳米颗粒在团聚过程中，形成“热点”结构[14]，对位于热点结构中的被测分子的拉曼信号产生极大的增强作用。峰位置的偏移可能是由于金粒子团簇的增大而发生了红移。其中1 002 cm-1归属于苯丙氨酸C=C对称伸缩振动；1 244 cm-1属于CmH面内变形振动[15]；1 444 cm-1表征-CH2的振动模式；1 538 cm-1属于卟啉呼吸振动模式，是血红蛋白的标志特征峰[16]。

由图7可以看出，共聚焦显微拉曼光谱仪和便携式拉曼光谱仪测定的血红蛋白SERS谱图主要峰形及特征峰位置相符合，检测结果具有一致性。因此，可用便携式拉曼光谱仪测定血红蛋白。本研究所采用的便携式拉曼光谱仪体积小，便于携带，可以应用的场所更为广泛，能够实现实时、实地的快速检测。

图6 共聚焦显微拉曼光谱仪测定血红蛋白固体标样、液体以及液体增强谱图对比Fig.6 Detection hemoglobin solid standards,liquids,and liquid enhancement spectra by confocal micro-Raman spectroscopy

图7 共聚焦显微拉曼光谱仪(a)和便携式拉曼光谱仪(b)测定的血红蛋白SERS谱图对比Fig.7 Comparison of SERS spectra of hemoglobin measured by confocal Raman spectroscopy(a) and portable Raman spectroscopy(b)

3 结论

利用便携式拉曼光谱仪，以纳米Au溶胶为增强试剂，建立了血红蛋白的SERS检测方法。结果表明，血红蛋白的拉曼特征峰强度与其质量浓度间具有较好的线性关系，且该方法具有较好的重现性，为蛋白质的快速检测提供一种新型的技术手段。