同位素稀释-液相色谱/质谱法测定生态纺织品中五氯苯酚残留

李志刚*

(浙江工业职业技术学院, 浙江绍兴 312000)

纺织品中残留的有毒有害物质可能对消费者健康造成的危害已越来越引起人们的重视[1]。五氯苯酚(PCP)作为一种廉价、高效的防腐剂和防霉剂常用于羊毛、棉纺织物、亚麻以及棉聚酯复合物等的储存和运输。它不仅具有很强的“三致”效应，而且在燃烧时会释放出二噁英类化合物，对环境造成持久性损害。已有实验数据证实五氯苯酚对人体的内分泌有干扰作用，残留在纺织品中的五氯苯酚会随着其对人体皮肤的接触而迁移至人体内，产生生物累积，危害健康。五氯苯酚的残留监测已列入生态纺织品的重要监控项目[2]，中国的生态纺织标准和国际生态纺织协会的Oeko-tex标准100均规定纺织品中的PCP残留量不得超过0.5 mg/kg，婴幼儿用品不得超过0.05 mg/kg。有关五氯苯酚的检测方法目前主要有：气相色谱法[3]、液相色谱法[4]、气相色谱/质谱法[5 - 7]、液相色谱/质谱法[8]以及液相色谱/串联质谱法[9 - 14]等。我国国家标准(GB/T 18414.1-2006)《纺织品 含氯苯酚的测定 第1部分：气相色谱-质谱法》采用气相色谱/质谱法检测纺织品中的五氯苯酚，但需要进行衍生化操作，而且采用外标法定量，对于复杂基质所带来的基质效应可能会影响其准确性。

本文利用液相色谱/串联质谱法测定，无需衍生化，前处理操作简单，同时采用同位素内标进行定量，克服基质效应。所建方法具有操作简便、准确灵敏的特点。此方法的建立为生态纺织品中其他低含量含氯苯酚检测提供了一定的理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AB 5500型三重四极杆-串联质谱仪(美国，AB SCIEX公司)；岛津UFLC XR型超快速液相色谱仪(日本，岛津株式会社)；Legend RT型离心机(德国，Heraeus公司)；HGC-24型氮吹仪(天津恒奥科技有限公司)；全玻璃溶剂过滤器(美国，Waters公司)；Milli-Q纯水系统(美国，Millipore公司)；固相萃取仪(美国，Supelco公司)。Waters Oasis©MAX固相萃取小柱(3 mL/60 mg，美国Waters公司)。

五氯苯酚标准品(含量99.5%，德国D.R公司)，内标13C6-五氯苯酚标准品(含量99.0%，德国D.R公司)。标准贮备溶液的配制：准确称取五氯苯酚标准品10.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，用少量甲醇溶解后，定容至刻度，制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，在0～4 ℃冰箱中保存备用。准确移取五氯苯酚标准储备液(1.0 mg/mL)10.0 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为1.0 μg/mL的标准使用液，在0～4 ℃冰箱中保存，备用。内标贮备溶液：准确称取13C6-五氯苯酚标准物质0.10 mg于1 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至1 mL，此时溶液的浓度为0.1 mg/mL，再用甲醇稀释100倍后，得到浓度为1.0 μg/mL的内标标准使用液，于0～4 ℃冰箱中保存，备用；甲醇、乙腈均为LC/MS级(美国Fisher公司)；正己烷、甲酸、氨水、NH4Ac均为色谱级(德国Merck公司)。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。

纯棉、真丝、纯羊毛、涤棉混纺、毛涤混纺等5个品种面料的50份样品，均采自浙江省绍兴柯桥轻纺城市场。

1.2 色谱/质谱条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ柱(100 mm×2.1 mm i.d.,2.2 μm)；流动相：A相为水(内含5 mmol/L NH4Ac+0.1%甲酸)，B相：乙腈-水(内含5 mmol/L NH4Ac+0.1%甲酸)(90∶10,V/V)；梯度程序：0～1.00 min，20%～95%B；1.00～3.00 min，95%B；3.00～3.01 min，95%～20%B；3.01～5.00 min，20%B。流速0.40 mL/min；进样量5.0 μL。

1.2.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；定量检测方式：多反应监测(MRM)模式；扫描方式：负离子扫描；雾化气压力(GS1)50.0 psi；辅助气流速(GS2)50.0 psi；气帘气压力(CUR)40.0 psi；碰撞气(CAD)8.0 psi；电喷雾电压(IS)-4 500 V；离子源温度(TEM)500 ℃；扫描时间50 ms；碰撞室出口电压(CXP)10.0 V；碰撞室入口电压(EP)10.0 V；定性离子对、定量离子对、碰撞气能量(CE)及去簇电压(DP)等参数见表1。

表1 五氯苯酚及其内标物的保留时间、定性定量离子对及碰撞能量、锥孔电压

1.3 样品测定

取10 g以上具有代表性的试样，剪碎、混匀。称取2.0 g已混匀的样品于50 mL离心管中，加入10 μL 的13C6-PCP内标使用液(1.0 μg/mL)，混匀后静置15 min，加入5%氨水乙腈溶液(70/30,V/V)提取液10 mL，漩涡混匀1 min，超声提取10 min，8 000 r/min离心5 min，吸取5 mL上清液于具塞试管内，加入2 mL水，混匀后，加入到已用6 mL甲醇和6 mL水活化与平衡过的MAX固相萃取小柱，分别用甲醇、水以及甲酸/甲醇/水溶液(2/49/49，V/V/V)各6 mL依次进行淋洗，抽干后，用8%甲酸甲醇溶液6 mL洗脱，洗脱液于40 ℃氮气吹至近干，用20%乙腈溶液复溶并定容至1.0 mL，经0.2 μm滤膜过滤后，待测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

实验分别考察了柱长均为100 mm的Shim-pack XR-ODS Ⅲ、Waters HSS T3以及Waters BEH C18三种常用的色谱柱，考虑在各自合适的流动相条件下五氯苯酚的色谱行为。实验证明，应用BEH C18柱和HSS T3柱时，待测化合物的峰形对称性不好，拖尾严重。而应用XR-ODS Ⅲ柱时，其峰形理想且灵敏度高。所以，实验选择XR-ODS Ⅲ色谱柱。

2.2 流动相的优化

实验首先试验了乙腈/水和甲醇/水体系下五氯苯酚的质谱行为。实验结果显示，在此体系下五氯苯酚的质谱响应非常低，说明化合物的离子化效率低下。随后实验分别添加NH4Ac、NH3·H2O和甲酸作为流动相改性剂来考察其质谱行为。结果表明，在流动相中单独添加NH4Ac、NH3·H2O或者甲酸，五氯苯酚的质谱响应均会有所增大，但是增加幅度不甚理想，同时添加NH4Ac和甲酸，使流动相形成缓冲溶液，待测物的质谱响应明显增加，而且保留时间也得到明显的改善。经过对NH4Ac和甲酸浓度的优化，最终选择在流动相中添加5 mmol/L NH4Ac和0.1%甲酸，在优化后的流动相条件下，五氯苯酚的保留时间为1.94 min。图1给出了五氯苯酚以及13C6-五氯苯酚内标的多反应监测(MRM)色谱图。

图1 五氯苯酚(A)和 13C6-五氯苯酚(B)多反应监测(MRM)色谱图Fig.1 MRM chromatograms of PCP(A) and 13C6-PCP(B)

2.3 质谱条件优化

实验根据五氯苯酚的结构特点，利用仪器自动优化程序，采用电喷雾电离源(ESI)在负离子化模式下对其质谱信号强度、稳定性及碎片离子进行试验。通过流动注射系统以10 μL/min的速度分别进样五氯苯酚(100 μg/L)和13C6-五氯苯酚(100 μg/L)标准溶液进行全扫描，得到m/z264.8和m/z266.8的五氯苯酚母离子和m/z270.8和m/z272.8的13C6-五氯苯酚母离子，通过优化去簇电压、碰撞气能量等质谱参数，获得化合物的碎片离子。优化后五氯苯酚的主要质谱参数见表1。

2.4 样品净化方法优化

由于五氯苯酚呈弱酸性，实验选择碱性乙腈对样品进行提取，由于基质的复杂性，为保护色谱柱，提高检测灵敏度，需对样品提取液进行净化。本实验选用固相萃取柱进行净化，从理论上推断选择阴离子交换柱能实现净化作用。在碱性条件下，五氯苯酚中的酚羟基与填料上季铵基发生离子交换作用而被吸附在小柱上，随后用酸性甲醇可以进行洗脱。由于上样后的填料上含有NH3·H2O以及其他杂质，所以需要先用甲醇淋洗疏水性杂质，用水淋洗NH3·H2O，然后用甲酸/甲醇/水溶液淋洗弱酸性干扰物质。实验考察了不同洗脱液比例与洗脱体积对洗脱效率的影响，以期获得最佳洗脱条件。结果如表2所示，用8%甲酸甲醇溶液进行洗脱时绝大部分的目标化合物都能被洗脱下来，当洗脱液体积达到6 mL时，有98.3%的五氯苯酚被洗脱下来，为了使强保留杂质不干扰测定，实验选择8%甲酸甲醇溶液作为洗脱液，洗脱体积为6 mL。

表2 洗脱液比例与洗脱体积对洗脱效率的影响(以回收率表示，%)

2.5 基质效应

在液相色谱/质谱检测技术中基质效应对测定结果准确性不容忽视，同位素稀释法被认为是补偿基质效应最理想的方法，这是由于同位素内标与待测组分在样品处理、色谱分离及质谱检测的整个过程中具有相似的行为，因此受基质效应的影响也一致。本实验使用13C6-五氯苯酚内标克服了基质效应。

2.6 方法确证

2.6.1 检出限和定量限利用制备的五氯苯酚及其内标标准溶液，分别吸取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μL五氯苯酚标准使用液(1.0 μg/mL)于7个1 mL容量瓶中，再各加入5.0 μL13C6-五氯苯酚内标使用液(1.0 μg/mL)，获得0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/L(含内标均为5.0 μg/L)的五氯苯酚标准系列，测定后绘制标准曲线。实验结果证明，五氯苯酚在0.5～50.0 μg/L范围内具有良好的线性，回归方程为：y=0.98x-3.6×10-4，相关系数(r)为0.9992。

分别取纯棉、真丝、纯羊毛、涤棉混纺、毛涤混纺等阴性样品各1份，每份称取2.0 g于50 mL离心管内，分别加入10 μL的13C6-PCP内标使用液(1.0 μg/mL)，再准确加入一定量的五氯苯酚标准溶液，制备成1.0 μg/kg的加标样品，静置4 h后，按拟定方法进行测定，根据色谱峰的信噪比(S/N=3)计算五氯苯酚的检出限(LOD)为0.15 μg/kg，以信噪比(S/N=10)确定其定量限(LOQs)为0.5 μg/kg。

2.6.2 回收率和精密度分别取纯棉、真丝、纯羊毛、涤棉混纺、毛涤混纺等阴性样品各1份，每份样品混匀后各称取6份，每份2.0 g于50 mL离心管内，分别加入10 μL的13C6-PCP内标使用液(1.0 μg/mL)，再准确加入一定量的五氯苯酚标准溶液，制备成低、中、高(1.0、10.0、40.0 μg/kg)的加标样品，静置4 h后，测定。重复测定6次，计算方法的回收率和精密度，结果见表3。不同样品五氯苯酚的回收率为80.0%～110.0%，相对标准偏差(RSDs)为1.56%～5.39%。

表3 五氯苯酚的回收率和精密度(n=6)

图2 典型的阳性样品多反应监测(MRM)色谱图Fig.2 MRM chromatograms of typical positive sample

2.7 样品测定

利用所建方法对纯棉、真丝、纯羊毛、涤棉混纺、毛涤混纺等5个品种的50份样品进行检测，其中1份纯棉，3份涤棉检出五氯苯酚，含量在1.74、5.46 μg/kg之间。典型的阳性色谱图见图2。

3 结论

本实验建立了一种简单、快速检测生态纺织品中五氯苯酚残留的液相色谱/串联质谱方法，样品经碱性乙腈提取后，使用MAX固相萃取小柱净化，同位素内标法定量。方法操作简便，准确性高，稳定性好，检出限为0.15 μg/kg，样品的加标回收率为80.0%～110.0%，五氯苯酚在0.5～50.0 μg/L范围内具有良好的线性，相关系数大于0.999。该方法的建立同时也为生态纺织品中其他氯酚的检测提供理论依据。