白腐真菌对甲基蓝的脱色

宋朝霞，付 佳，王 艳，黄 锋

(河南工程学院 资源与环境学院，河南 郑州 451191)

三苯甲烷类染料是目前常用的三大类染料之一，具有致癌、致畸、致突变的缺点[1]。该类染料具有特殊的化学结构，在自然界中很难被降解，给人类健康和自然生态平衡造成了巨大的压力。自然界中存在具有降解染料能力的微生物，如细菌、白腐真菌、放线菌和藻类等，尤其是白腐真菌具有底物广泛性、降解效率高、能耗低、适应性强等特点[2]，在染料废水的处理上具有广阔的应用前景。在筛选得到白腐真菌的基础上，本研究以三苯甲烷类染料甲基蓝为处理对象，考察白腐真菌在不同温度、pH值、染料浓度与葡萄糖浓度等条件下对甲基蓝脱色率的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1菌源

菌种样品取自河南工程学院校园里的自然朽木，经分离纯化后得到。

1.1.2培养基

愈创木酚培养基：酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，愈创木酚25 mL/L，琼脂15 g/L，pH值为7。

PDA液体培养基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值。PDA固体培养基另加2%的琼脂粉。

1.2 实验方法

1.2.1菌株的分离、纯化

将腐朽木段经 75%酒精表面消毒后，取一定量朽木样品置于灭菌生理盐水中，摇床振荡30 min，对悬浮液进行梯度稀释。取稀释液涂布于愈创木酚初筛培养基上，30 ℃恒温静置培养3 d。白腐真菌能够在愈创木酚培养基上产生粉红色透明圈，选取产生粉红色透明圈的菌株继续划线分离直至培养出纯菌株。将纯化的菌丝转移至PDA 斜面，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2菌株形态学鉴定

参照魏景超的《真菌鉴定手册》[3]对菌株进行形态特征鉴定。将菌种接种至PDA培养基上，30 ℃培养，观察菌株在整个生长过程中的变化，包括菌落形态、颜色、表面状况、边缘是否整齐、生长速度、干燥情况、正反面差异等。

用接种环挑取少许菌丝，浸润在含有纯净水的载玻片上，经烘烤定型后使用亚甲基蓝染液染色4 min，盖上盖玻片，用蒸馏水冲洗掉染液，待干后在显微镜下观察。

1.2.3菌丝体的制备

将活化的菌丝体接种到PDA液体培养基中，控制摇床转速为120 r/min，在30 ℃下持续通风培养3 d左右，直至PDA液体培养基中长出均匀的菌球。

1.2.4甲基蓝标准曲线的绘制

配制质量浓度分别为10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L和90 mg/L的染料标准液，使用紫外可见分光光度计在530 nm处测定该染料标准液的吸光度，以浓度为x轴、吸光度为y轴，绘制染料标准曲线。

1.2.5脱色实验流程

向培养好白腐真菌发酵液的锥形瓶中加入一定量的无菌模拟染料废水后置于摇床中进行脱色实验。

1.2.6染料脱色率的计算

染料脱色率计算公式为

(1)

式中：t为脱色率；A为脱色前染料的初始吸光度；Ai为脱色后染料的吸光度。

2 结果与分析

2.1 菌株选育

经过分离纯化得到一株在愈创木酚培养基上能够产生明显粉红色透明圈的真菌，该菌菌落呈白色，圆形，表面呈绒毛状，干燥，边缘整齐，菌落不透明，菌落特征如图1所示。对该菌株进行染色镜检，菌株有发达的菌丝体，有多核菌丝，有隔膜、锁状联合，符合白腐真菌镜检特征，编号SH02，如图2所示。

图1 菌株SH02菌落Fig.1 Colony of the strain SH02

图2 菌株SH02镜检结果Fig.2 Microscopic examination of the strain SH02

2.2 白腐真菌脱色实验

2.2.1染料标准曲线的建立

甲基蓝标准曲线见图3。由图3可知，甲基蓝标准液的吸光度与甲基蓝质量浓度为0～90 mg/L时呈线性相关，线性回归方程为y= 0.007 3x-0.012 8，R2= 0.998 9。在脱色实验中可采用该线性回归方程计算溶液中甲基蓝的浓度。

2.2.2染料初始浓度对脱色率的影响

在pH值为7、恒温30 ℃的条件下，考察白腐真菌在不同染料浓度下对甲基蓝脱色效果的影响，结果如图4所示。

图3 甲基蓝标准曲线Fig.3 Standard curve of methyl blue

图4 甲基蓝初始浓度对菌株SH02脱色率的影响Fig.4 Effect of methyl blue concentration on the decolorization rate by SH02

由图4可知，甲基蓝初始质量浓度为10～50 mg/L，随着浓度的增大白腐真菌脱色率不断增大，当甲基蓝初始质量浓度达到50 mg /L时，脱色率为60.3%，但染料初始浓度继续增大，脱色率急剧下降，当染料初始质量浓度达到70 mg/L时，脱色率仅为29.9%。分析原因可能是因为染料浓度不断提高对菌丝体的毒性逐渐增大，导致白腐真菌菌丝体的生长或酶的分泌受到抑制，最终影响菌丝体对染料的脱色效果。

2.2.3初始pH值对脱色率的影响

在甲基蓝初始质量浓度为 50 mg/L、恒温30 ℃的条件下，在pH 值为2～8时考察白腐真菌脱色效果，结果如图5所示。从图5可以看出，在不同pH值缓冲体系中，白腐真菌对甲基蓝染料的脱色效果有明显的区别。其中，在pH值为5～7的条件下，体系中甲基蓝的脱色率相对较高，尤其是在pH值为6时，脱色效果最好，脱色率达到69.7%。当体系pH值小于5时，脱色率随pH值的降低而显著降低。分析原因可能是由于pH 值的变化直接影响真菌表面所带电荷的电性及甲基蓝的电离状态，进而影响微生物与染料分子的结合能力，最终导致脱色效果的差异，也可能是由于pH 值的变化对白腐真菌产生特定的染料降解酶有影响[4]。

2.2.4温度对脱色率的影响

以甲基蓝初始质量浓度为 50 mg/L、pH值为6的模拟染料废水为研究对象，考察白腐真菌在不同温度下对甲基蓝的脱色效果，结果如图6所示。

图5 初始pH值对菌株SH02脱色率的影响Fig.5 Effect of initial pH on the decolorization rate by SH02

图6 不同温度对菌株SH02脱色率的影响Fig.6 Effect of temperature on the decolorization rate by SH02

由图6可知，当脱色温度为30 ℃时，白腐真菌对甲基蓝的脱色效果最好，脱色率达到66.2%，一旦温度低于30 ℃，脱色效果会变差。从图6中还可以看出，在25～30 ℃条件下脱色率明显高于15～20 ℃时。温度对脱色效果的影响主要是因为温度的变化直接影响染料降解酶的活性和稳定性，酶在最适温度范围内活性最大，酶促反应速度最快。温度过低，酶不能充分发挥其活性，而温度过高，酶容易变性失活，都会导致酶的催化效率降低，最终影响脱色率。已有研究表明，白腐真菌的最适温度为25～30 ℃，温度过低，白腐真菌菌丝体生长缓慢，温度过高则白腐真菌菌丝体易衰亡[5]。

2.2.5葡萄糖浓度对脱色率的影响

张庆云等[6]研究发现糖类(果糖) 作为共代谢基质对混合菌群脱色降解活性黑5有一定的促进作用。程永前等[7]和林锦美等[4]也有研究表明，投加一定量的外加碳源-葡萄糖能提高白腐真菌的脱色能力。因此，在恒温30 ℃、甲基蓝初始质量浓度 50 mg/L、pH值为6的条件下，考察外加碳源-葡萄糖对甲基蓝脱色效果的影响，结果如图7所示。

由图7可知，当体系中不添加葡萄糖时脱色率为66.5%，当葡萄糖质量浓度为0.2 g/L时脱色率最高，达到78.9%，之后随着葡萄糖浓度的进一步升高，脱色效果变差。分析原因可能是在碳源相对缺乏的情况下，菌株会分泌相应的酶类对染料进行降解，使其转化成菌体可以利用的物质以维持细胞生长，而在碳源相对充足的情况下，菌株优先利用葡萄糖进行生长，染料降解酶分泌较少，不利于脱色。

2.2.6脱色机制推测

甲基蓝作为一种常见的三苯甲烷类染料，具体结构如图8所示。其中，醌型苯环形成大的共轭体系是主要的发色团，氨基作为助色团，两者共同反映染料颜色[8]。在脱色过程中，白腐菌SH02菌球始终呈现乳白色，说明微生物是依靠分泌到胞外的木质素氧化酶系作用于发色团或助色团对染料进行脱色的。甘莉等[9]在利用菌株B.Cepacia C09G 对孔雀绿进行脱色的实验中，也通过光谱分析说明孔雀绿的—NH2、—NH/CO等官能团被破坏。

图7 不同葡萄糖浓度对菌株SH02脱色率的影响Fig.7 Effect of glucose concentration on the decolorization rate by SH02

图8 甲基蓝分子结构 Fig.8 Structure of the methyl blue

3 结语

从河南工程学院校园朽木上分离到一株白腐真菌，利用其对甲基蓝进行脱色，通过单因素实验，最终确定在甲基蓝质量浓度为50 mg/L、pH值为6、葡萄糖添加量为 0.2 g/L时的脱色体系，白腐真菌在30 ℃时对甲基蓝的脱色效果最好，脱色率达到78.9%。