滋阴补肾方对糖尿病合并去卵巢骨质疏松大鼠的作用及对Wnt/β-catenin信号的影响

孙勤国 徐鸿婕 罗蒙 江波* 吕琨 杨倩 黄天慧 张贤梅

1．武汉大学同仁医院(武汉市第三医院)中医科，湖北 武汉 430060 2．湖北中医药大学第一临床学院，湖北 武汉 430060

糖尿病合并骨质疏松(osteoporosis, OP)是一种全身性代谢性骨病，主要特征为骨量系统性减少、骨组织结构退化，是一种代谢障碍性疾病[1-3]。糖尿病合并骨质疏松可导致骨强度降低、骨密度降低、骨脆性增加，发生骨折的风险增加，是目前世界上发病率较高，医疗支出负担较重的慢性疾病之一。进入更年期的妇女，由于卵泡数量明显减少，卵巢功能低下，从而雌激素(E2)缺失和衰老的叠加作用，使得OP在绝经后妇女人群中的发病率相对较高[4-5]。骨是E2发挥作用的主要靶器官之一，E2缺乏导致骨代谢中破骨细胞和成骨细胞的之间的相互制衡关系被打破，破骨细胞数量增加，骨吸收与骨重建的失衡，最终导致骨量丢失[6-9]。因此，对于糖尿病合并骨质疏松的治疗和研究迫在眉睫。

Wnt/β-catenin信号通路是调控成骨分化的一条重要通路，β-catenin调控细胞增殖、定向分化过程[10]。李俊峰等[11]研究认为Wnt/β-catenin信号通路在调节调控骨量上发挥重要作用。滋阴补肾方由生龙骨、生牡蛎、桑寄生、续断、淫羊藿、天花粉、黄连组成。生龙骨和生牡蛎常相须为用，以治阳亢、益阴。董佳梓等[12]通过研究具有滋补肾阴作用桑寄生、枸杞子和桑椹对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的治疗作用及其机理，桑寄生的作用是促进OPG蛋白表达，降低IL-1含量；商学征等[13]观察补肾通络中药(淫羊藿、黄芪、鹿角胶、生地黄、补骨脂、女贞子、三七、丹参、地龙)可明显改善糖尿病骨质疏松患者超声骨密度，调节平衡能力。本研究以糖尿病合并去卵巢骨质疏松大鼠为对象，探索滋阴补肾方对其作用及其相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

50只SPF级雌性SD大鼠，3月龄，体质量(250±14)g，购于湖北省疾病预防控制中心。饲养环境室温控制在23 ℃左右，湿度60%左右，自然光源，标准饲养，自由饮水一周，适应环境。将大鼠分为正常对照组、模型组、骨化三醇组、滋阴补肾方低剂量组、滋阴补肾方中剂量组、滋阴补肾方高剂量组。大鼠的模型建立方法：腹腔内注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg，麻醉成功后，固定大鼠向上，常规消毒，无菌条件下于大鼠最末肋骨下，腋中线至脊柱外侧约1 cm处备皮，切开皮肤、肌肉和腹膜，轻轻拉出脂肪团暴露卵巢，结扎卵巢下端输卵管，摘除双侧卵巢，止血后，逐层缝合，关腹。缝合切口，外敷消炎粉。术后正常饲养，切口每日消毒。进食高糖高脂饲料。喂养14 d之后，禁食12 h后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，30 mg/kg，一次性注射。造模成功后，灌胃给药8周，每日一次。骨化三醇组灌胃骨化三醇0.1 μg/(kg.d)。滋阴补肾方由生龙骨30 g、生牡蛎30 g、桑寄生10 g、续断10 g、淫羊藿10 g、天花粉10 g、黄连10 g组成；以上药物均购于同仁医院中药房，经过中药传统方法浸润、煎煮、过滤、浓缩制成煎剂，按人与大鼠给药换算比计算相当生药量5、10、20 g/(kg.d)制成低、中、高剂量。

传统水轮发电机组振动在线监测与故障诊断系统基本都是采用单机式集中控制系统，利用变送器和传感器将所有监测机组的状态参量、电量以及非电量信号收集到计算机中，并按照相关规定进行计算、判断和维修。由于该集中控制系统具有较多的缺陷，如果中央控制计算机一旦出现故障，那么整个生产过程就会瘫痪。

p-NF-kB兔抗，购于Abcam，货号：ab28856；NF-kB兔抗，购于Abcam，货号：ab16502，IkB兔抗，购于Abcam，货号：ab7217；MyD88兔抗，购于Abcam，货号：ab131071；GAPDH兔抗，购于Cell Signaling Technology，货号：2118；Goat Anti-Rabbit IgG羊抗，购于Bioswamp，货号：PAB160011。

骨组织以液氮冷冻后钢锤砸碎，加入超声裂解细胞，超声裂解。4 ℃下15 000 r/min离心30 min，吸取上清液获取总蛋白。根据BCA蛋白定量结果上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳2.5 h，转膜后NC膜TBS稍荡洗，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃下分别孵育p-NF-kB(稀释比为1∶1 000)，NF-kB(稀释比为1∶2 000)，IkB(稀释比为1∶2 000)，MyD88(稀释比为1∶2 000)一抗过夜，TBST洗10 min×3次，室温孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重复3次，曝光显影；采用 BIO-RAD Image Lab 软件进行灰度值分析。

1.2 HE染色

用Trizol法提取组织总RNA后反转录得到cDNA。PCR扩增条件为95 ℃变性5 min后；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，72 ℃延伸5 min。目标基因的表达量用2-ΔΔCt法计算。PCR引物经Primer 6.0软件设计，如下表1。

1.3 Western blot

2.5 m时的过流能力分别为0.442 m3/s、1.070 m3/s。 按式(1)计算得出鱼道池室的容积功率耗散约为19.92 W/m3、19.29 W/m3，紊动不剧烈，适合鱼类上溯。

1.4 ELISA检测血清中相关指标的变化

AS属于中医学“脉痹”范畴，为正气亏虚，五脏功能失调，痰瘀互结阻于脉道所致，热毒内蕴是易损斑块病机演变的重要环节。临床治疗当随证治之，扶正补虚法、活血化瘀法和清热解毒法常联合使用，通过调节血脂、抗氧化、保护内皮功能、抗血小板聚集黏附、抗血栓及抗血管平滑肌增殖等机制，以发挥中医药多环节、多途径、多靶点治疗AS的优势，全面干预AS的发生和发展。

1.5 RT-PCR

给药周期结束后，断头处死大鼠，脱钙后的胫骨经过脱水，包埋于蜡块中，以5 μm的厚度均匀切片。将苏木精加入蒸馏水内加温溶解，冷却后加入乙醇和甘油，备用。石蜡切片脱蜡至水。用Regaud苏木精染液染核7 min。置于容器中，流水冲洗2 h。以1%的盐酸乙醇溶液分化3 s，用伊红染液染色5～10 min。用95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固，光镜下观察各组大鼠胫骨骨小梁病理变化。

和正常对照组比较，模型组的p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88表达水平均升高；和模型组比较，骨化三醇组，中剂量组和高剂量组的p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88表达水平均降低。

表1 引物列表Table 1 Primer sequences

1.6 统计学处理

同时，宁夏图书馆设立少儿图书分馆，为青少年读者提供了良好的阅读环境，增加的各种图书和绘本也吸引了更多青少年读者。亲子阅读也将成为今后重点活动之一。

2 结果

2.1 滋阴补肾方对胫骨形态的影响

和正常对照组比较，模型组大鼠的骨小梁排列紊乱疏松干瘪，小梁宽、间距变大，骨小梁之间连接变少。滋阴补肾方低剂量组胫骨排列较紊乱疏松干瘪，小梁间距较大，连接较少。滋阴补肾方中剂量组胫骨排列较疏松，整齐，小梁宽、间距变小，之间连接渐变多；滋阴补肾方高剂量组胫骨骨小梁排列较密集，骨小梁之间连接增多。

以ELISA的方法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平。根据试剂盒的说明书稀释标准品。绘制标准曲线。在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50 μL。分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗体，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40 μL，然后再加生物素标记的抗体10 μL。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。

图1 滋阴补肾方对胫骨形态的影响(×100)Fig.1 Effect of nourishing Yin and tonifying kidney recipe on the morphology of the tibia (×100)

2.2 滋阴补肾方对炎症相关通路的影响

观察组治疗总有效率96.88%（显效18例+有效13例）；对照组治疗总有效率78.13%（显效13例+有效12例）。两组数据比较，观察组治疗总有效率高于对照组，差异有统计学意义（x2=5.14，P＜0.05）。

图2 与炎症相关蛋白和基因的表达注：图2 A为p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88蛋白的表达；图2B、图2C、图2D分别为Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的表达水平；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Fig.2 Expression of inflammation-related proteins and genes

检测Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的mRNA表达水平见图2。和正常对照组比较，模型组的Wnt-3α、LRP-5、β-catenin表达水平均显著降低(P<0.05)；和模型组比较，骨化三醇组，中剂量组和高剂量组的Wnt-3α、LRP-5、β-catenin表达水平均显著升高(P<0.05)。

2.3 滋阴补肾方对血清中相关指标

和正常对照组比较，模型组的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平均显著升高(P<0.05)；和模型组比较，骨化三醇组，中剂量组和高剂量组的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平均显著降低(P<0.05)。

表2 滋阴补肾方对血清中相关指标的影响Table 2 Effect of nourishing Yin and tonifying kidney recipe on the related indicators in serum

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

糖尿病合并骨质疏松是一种全身性代谢性骨病，其主要是由于患者体内代谢平衡被打破、骨密度降低等特点导致骨组织微结构被破坏，骨脆性增加，从而使患者骨折风险大大增加，给患者带来不便和困苦[14]。近年来，Wnt/β-catenin信号通路对骨代谢的影响日益受到关注。β-链蛋白(β-catenin)在Wnt信号通路中起到关键性作用[15-16]。C3H10T1/2细胞是可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等多种细胞的多潜能干细胞系，在BMP-2的作用下可以分化为成骨细胞[17]。Bain等[18]发现，BMP-2可以促进C3H10T1/2细胞分化为成骨细胞，在此过程中，在BMP-2的调控下，C3H10T1/2细胞过渡表达β-catenin，使成骨细胞分化的早期标志物ALP表达活跃。此外，Wnt参与成骨细胞分化形成的过程。稳定表达Wnt1/Wnt3α能促进C3H10T1/2细胞系的增殖，并激活标志物ALP的活性[19]。Wnts不仅促进了成骨细胞的生长，还能促进成骨细胞早期分化的过程。LRP-5表达于成骨细胞的表面，对骨量的积累过程中起到重要的作用，LRP-5的功能丧失性突变可导致骨量减少，骨质疏松；功能获得性突变能够导致高骨密度症。它还是Wnt蛋白的跨膜蛋白，通过Wnt/LRP-5信号通路调节成骨细胞的增殖和分化，从而影响人体骨量的积累[20]。有研究证明，LRP-5的表达改变或者功能丢失，可阻止骨质的获得，致使体外培养鼠的头盖骨质密度降低，骨质厚度变薄[21-22]。本文研究了糖尿病合并去卵巢骨质疏松大鼠在滋阴补肾方的作用下，Wnt/β-catenin和Wnt/LRP-5信号通路的表达情况。结果显示，糖尿病合并去卵巢骨质疏松大鼠经过滋阴补肾方的干预作用后，Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的表达均升高，提示滋阴补肾方可通过激活Wnt/LRP-5和Wnt/β-catenin信号通路，可能增加成骨细胞的数量，增加骨量。这和滋阴补肾方高剂量组胫骨骨小梁排列较密集，骨小梁之间连接增多的结果相符。

研究发现，糖尿病肾病是一种炎症疾病。在糖尿病合并骨质疏松的发展过程中，肾小球和肾小管的炎症反应为其主要的病症之一。炎性细胞大量浸润及细胞因子、趋化因子等炎症反应因子的产生在糖尿病的损害中发挥重要作用[23]。其中TLR-MyD88信号通路在炎症信号的传导中起着至关重要的作用。MyD88参与了糖尿病炎症反应和发展的全过程，它调控的下游因子NF-κB可激活多种炎症因子(IL-6，IL-10等)的表达来发挥作用，此外，可调节TGF-β1的表达致使肾脏的纤维化。因此，TLR-MyD88信号通路是糖尿病炎症反应中，导致NF-κB活化的关键性通路[24-25]。糖尿病合并去卵巢骨质疏松大鼠经过滋阴补肾方的干预作用后，p-NF-κB、NF-κB、IkB以及MyD88蛋白表达水平均显著降低，提示滋阴补肾方抑制了MyD88和NF-κB的表达，可能有效抑制了其相关的炎症通路。同时，TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10等炎症因子的水平随着滋阴补肾方的剂量而逐渐降低，提示滋阴补肾方对机体的糖尿病症有所缓解，可达到增加骨密度的目的。

综上，滋阴补肾方治疗糖尿病合并去卵巢骨质疏松大鼠可显著增加其成骨细胞的数量，增加骨量，可能是通过抑制NF-κB炎症通路，并激活Wnt/β-catenin信号通路对其产生影响。