固本增骨方含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

宋敏 巩彦龙 董万涛 刘小钰 董平,3 黄凯 王凯

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020 3.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010010

在全世界老龄化的背景下，老年性骨质疏松症(osteoporosis，OP)的发病率呈递增趋势，其中绝经后OP性骨折的终生风险可能在13%～25%，并且随着寿命的增长而增加了骨折的风险[1]。多种因素影响了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞(osteoblast，OB)的分化[2]，而OP发生、发展与OB及破骨细胞(osteoclast，OC)调控的骨代谢动态平衡失调密切相关。目前，治疗OP的西药在治疗的同时又有某种不理想因素；而中医药通过中医药理论的指导，对人体机能的全方位调节防治OP，疗效显著、副作用小，对OP的防治有积极作用。本研究通过定向诱导BMSCs向OB分化模型，运用固本增骨方含药血清对其定向分化过程的干预，以观察固本增骨方含药血清对该过程的影响并阐明影响该过程的可能机理。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1动物与细胞：SPF级3月龄Wistar大鼠30只，体重(200±20) g；Wistar大鼠BMSCs(货号：RAWMX-01001，规格：1×106个细胞/管；冻存代次：P1；保存条件：液氮)。

1.1.2主要药品与试剂：购于甘肃中医药大学附属医院的固本增骨方，制成药粉后配成25 g/L混悬液。浓度为0.1%的明胶(货号：RAWMX-90011，RAWMX-90021，T170313G001)。SDS-PAGE试剂盒、茜素红(批号：20170802，p1200，T170512G001)。购于GeneTex公司的BGP兔多克隆抗体(批号：821703974)，购于ImmunoWay公司的Runx2兔多克隆抗体、GAPDH(批号：B4135，B5601)。

1.1.3主要仪器：凝胶电泳仪、凝胶成像分析仪(美国 Bio-rad公司生产，PowerPoc Basic，ChemiDocTMXRS+)及PCR荧光定量仪(C1000)。

1.2方法

1.2.1固本增骨方含药血清的制备：上述动物按随机表法分为空白血清组和含药血清组(各15只)，后者以10 mL/kg剂量、2次/d灌胃，前者给予等量生理盐水，干预一周后心脏取血，离心取上清灭火、除菌后备用。

1.2.2Wistar大鼠BMSCs的培养：BMSCs经复苏，培养后重悬，台盼蓝染色观察适宜密度为3.0×104个活细胞/cm2，将细胞接种分瓶后在条件适宜的培养箱中传代，最终培养出符合实验要求BMSCs。

1.2.3分组与造模：将传至P3代BMSCs分为空白血清组、传统成骨诱导组、传统成骨诱导+不同浓度(5%、10%、20%、30%)含药血清组。将上述细胞接种于相应培养基上培养24 h，弃去培养基，并依次按实验分组分别加入空白血清、传统成骨诱导液及传统成骨诱导液+各浓度含药血清继续培养。从24 h后开始连续5 d测量各组细胞计数。

1.2.4茜素红染色：4周后甲醛固经茜素红染色后，光镜下观察钙结节数。

1.2.5细胞BGP、Runx2蛋白表达检测：提取各组细胞总蛋白保存后备用，每组BGP、Runx2蛋白检测均按照WB标注操作步骤进行，并分析各组条带，所得灰度值与内参比较得到BGP、Runx2的蛋白相对表达量。

1.2.6细胞BGP、Runx2 mRNA表达的检测：TRIZOL法提取各组总RNA、测定含量。取总RNA 2μg，逆转录合成规范操作第一链cDNA。扩增片段长度150 bp、86 bp、51 bp分别对应GAPDH、BGP、Runx2。按荧光定量试剂盒操作流程行RT-PCR反应及PCR扩增。将所得数据统计分析。

1.3统计学处理

2 结果

2.1BMSCs培养结果

细胞传至第三代时可见其呈顺向排列生长，并且生长良好，见图1。

图1 P1、P2、P3代BMSCs镜下形态 A：P1代BMSCs培养5 d(×10)；B：P2代BMSCs培养5 d(×10)；C：P3代BMSCs培养5 d(×10)。Fig.1 Microscopic morphology of P1, P2 and P3 BMSCs. A: P1 BMSCs were cultured for 5 days (× 10); B: P2 BMSCs were cultured for 5 days (× 10); C: P3 BMSCs were cultured for 5 days (× 10).

2.2各组细胞茜素红染色结果比较

镜下观察可见传统成骨诱导组红色钙结节数量明显多于空白组；含药血清组(5%、10%、20%)随着浓度增加，红色钙结节数量也逐渐增加，尤其浓度在20%时，红色钙结节数量最为显著，且显著高于空白组与传统成骨诱导组，当浓度增加到30%时，钙结节数量呈下降趋势，结果见图2。

图2 各组细胞茜素红染色结果(×40) A：5%含药血清组；B：10%含药血清组；C：20%含药血清组；D：30%含药血清组；E：空白血清组；F：传统成骨诱导组。Fig.2 Alizarin red staining results of cells in each group (×40). A: 5% drug-containing serum group; B: 10% drug-containing serum group; C: 20% drug-containing serum group; D: 30% drug-containing serum group; E: Blank serum group; F: Traditional osteogenesis induction group.

2.3各组细胞BGP、Runx2蛋白表达比较(图3，表1)

2.4各组细胞BGP、BGP mRNA表达比较(表2)

3 讨论

年龄增长骨量和骨骼强度下降，在老年以后伴随着量减少和骨骼强度下降后骨细胞死亡增快而骨细胞新生相对减少，这包括OC导致的破骨细胞作用占主要地位，而OB的成骨作用减低，并且导致骨细胞死亡是多因素作用的结果[3]。老年妇女中的OP患者因OP可直接导致髋部骨折及椎体压缩性骨折，对于大多数患有骨质疏松症的妇女来说，早起治疗具有积极的意义[4]。BMSCs是有着多向分化潜能的干细胞，在细胞因子、基因等因素的作用下其可以分化为OB[5]，而调上述因素对BMSCs调节异常将导致骨量丢失和OP发生[6]。研究显示，BMSCs的异常分化能促进或抑制骨质疏松症的发生[7]。

图3 各组细胞BGP、Runx2蛋白表达注：A、B、C、D分别为5%、10%、20%、30%含药血清组；E为空白血清组；F为传统成骨诱导组Fig.3 Expression of BGP and Runx2 in cells of each group

组别BGP/GAPDHRunx2/GAPDH5%含药血清组0.76±0.04Δ0.88±0.08Δ10%含药血清组0.85±0.07Δ1.00±0.03Δ20%含药血清组1.04±0.11Δ▲1.10±0.05Δ▲30%含药血清组0.82±0.02Δ0.85±0.09Δ空白组0.72±0.050.81±0.14传统成骨诱导组0.74±0.04Δ0.83±0.01ΔF值10.0515.770P值0.0010.006

注：与空白组比较，ΔP<0.01；与5%、10%、30%含药血清组及传统成骨诱导组比较，▲P<0.01。

组别BGPRunx25%含药血清组1.82±0.24Δ1.24±0.29Δ10%含药血清组2.05±0.32Δ1.6±0.18Δ20%含药血清组2.95±0.22Δ▲2.18±0.20Δ▲30%含药血清组1.68±0.191.06±0.15Δ空白组1.00±0.001.00±0.00传统成骨诱导组1.63±0.30Δ1.02±0.27ΔF值10.51011.898P值0.0000.000

注：与空白组比较，ΔP<0.01；与5%、10%、30%含药血清组及传统成骨诱导组比较，▲P<0.01。

本实验研究结果显示，大鼠P1代BMSCs复苏后镜下观察可见呈短梭形贴壁生长；BMSCs培养符合实验要求。茜素红可识别细胞内的钙盐[8]，本实验中BMSCs经28 d成骨诱导培养后行茜素红染色，镜下见红色钙结节数量随含药血清浓度增加(5%、10%、20%)而增加，在浓度为20%时红色钙结节数量最多，并且明显多于空白组与传统成骨诱导组，但当含药血清浓度为30%时，红色钙结节数量下降，这与最佳药物浓度有关。非胶原蛋白BGP可特异性地标志骨形成，在骨形成、维持骨量、骨重塑时，BGP的重要作用是一方面其能抑制异常羟磷灰石结晶的形成，另一方面其能促进软骨的矿化速率[9]。Komori等[10]首次报道了由于缺乏Runx2因子而引起成骨细胞不成熟，进而缺乏膜内和软骨内骨化。Runx2在骨形成期间调节成骨细胞和软骨细胞的分化，是BMSCs成骨分化的关键因子及骨形成的标志基因[11]。本实验研究结果显示，BGP、Runx2基因及蛋白的表达在20%浓度含药血清组达水平呈现峰值。由本研究结果可见，固本增骨方含药血清能通过促进BMSCs中BGP、Runx2基因转录及蛋白的表达，诱导BMSCs向成骨细胞分化，并且当含药血清浓度为20%时这种诱导作用较明显。

从20世纪60年代，更年期和骨质疏松之间的联系首次被确认，此后雌激素治疗OP成为预防骨丢失的重要措施之一[12]。截至目前，基于对骨生物学的理解，西医对OP的治疗主要包括抑制骨吸收药及促进骨形成药，对因治疗方法单一并且在一定方面不理想。中药在“整体观、辨证论治”指导治疗OP时，着眼于对机体整个机能的调节，标本兼顾，取得了良好的疗效。固本增骨方是甘肃中医药大学宋敏教授基于中医理论从“脾肾”论治而治疗OP多年的经验方，由炙黄芪、白条党参、岷当归、炙淫羊藿、烫狗脊、盐补骨脂组成，诸药合用，能益气健脾、补肾壮骨、活血通络之功效，标本兼顾[13]，能有效缓解老年脾肾两虚型骨质疏松症状。