熊果酸对CIA大鼠关节软组织RANKL、RANK、OPG mRNA表达的影响

周 俭，曾 光*，鲜瑶瑶，刘沙

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.漯河市中心医院，河南 漯河 462300)

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以掌指关节、近端指间关节及腕关节为主的对称性、小关节肿痛为临床表现的系统性疾病，在RA患者的活动期甚至伴有胸膜炎、间质性肺炎、肝脾大等累及其他系统疾病，病情控制欠佳患者后期可出现关节损伤伴随功能受限。RA的诊疗目的主要为控制炎症，减轻患者关节疼痛状态、防止关节破坏等。若RA病情未能及时控制时，则会出现关节畸形、活动受限等不可逆的损害。故类风湿关节炎骨保护是目前治疗类风湿关节炎的重要目标。熊果酸(ursolic acid，UA)，化学名3β-羟基-熊果-12-烯-28-甲酸(3β-hydroxyurs-12-env28-oic acid)，是非极性的五环三菇酸，其广泛存在于植物界中，与药用植物如栀子、连翘、山茱萸、白花蛇舌草等同样分布广泛[1-2]，不仅能抑制癌细胞生长，诱导癌细胞凋亡等抗癌作用，在抗心血管疾病、恢复肝功能等同样起着重要作用[3-5]，在过去的数年里，越来越多的研究表明UA具有一定的骨保护作用[6]。

RA的骨破坏机制复杂，细胞核因子κB受体活化因子配体(Nuclear factor kappa B receptor activating factor ligand，RANKL)/细胞核因子κB受体活化因子(Nuclear factorκB receptor activating factor，RANK)/骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)通路在RA的关节研究中起着重要作用。为进一步探讨UA的骨保护作用，本实验以胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠为模型，观察熊果酸对 CIA大鼠关节软组织RANKL、RANK、OPG mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠(购于斯莱克景达公司)，8周龄，雌性，体质量(120±10)g，SPF级实验室正常饲养1周后实验。

1.1.2 试剂 牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex)；弗氏不完全佐剂(Sigma)；熊果酸标准品(纯度98%)，Delta标准品公司提供；甲氨蝶呤片，规格：2.5 mg，上海信谊药厂有限公司生产。大鼠RANKL、RANK、OPG引物，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 实验仪器 7500PCR仪(美国 ABI)；T10 basic匀浆机(德国 IKA)。

1.2 方法

1.2.1 造模与评估 取70只雌性SD大鼠。随机选取10只作为空白对照组，其余大鼠均复制CIA模型[7]。

1.2.2 关节炎指数(AI)评分 用关节炎指数(AI)作为判断模型是否成功的标准。肢体关节肿胀按0～Ⅳ级评分：0，无红肿；Ⅰ，趾关节稍肿；Ⅱ，趾关节及足趾关节肿胀；Ⅲ，踝关节以下足爪肿胀；Ⅳ，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。AI值=四肢肢体关节肿胀级评分之和(Ⅰ级为1分，总分为16分)。AI≥4分为造模成功，本次成功率约为70%。

1.2.3 分组与给药 将造模成功的CIA大鼠随机分为CIA模型组(CIA)、熊果酸低剂量组(50 mg/kg)、熊果酸高剂量组(100 mg/kg)、甲氨蝶呤组(MTX)、熊果酸+甲氨蝶呤组(UA+MTX)，每组各6只。在初次免疫12d起，熊果酸组给予熊果酸灌胃(分别为50 mg/kg/d和100 mg/kg/d)，甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤(0.9 mg/kg/w)灌胃，熊果酸联合甲氨蝶呤组给予熊果酸(50 mg/kg/d)加上甲氨蝶呤(0.9 mg/kg/w)灌胃，空白组和CIA模型组大鼠分别给予等体积生理盐水灌胃，于初次免疫30 d，断颈处死大鼠，取炎症关节进行研究。

1.3 指标检测

1.3.1 检测大鼠关节软组织RANKL、RANK、OPG mRNA表达检测 于初次免疫 30 d，取大鼠炎症关节，组织匀浆，按说明书提取各组 RNA。使用 Nanodrop2000690检测RNA浓度及纯度，将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为 500 ng/μL。按照 RTRCR试剂盒说明书将RNA反转录合成 cDNA，各引物序列见表1。取上述反应产物2.0 μLcDNA。配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管：2×qPCR Mix 12.5 μL；上游引物2.0 μL；下游2.5 μL；ddH208.0 μL。反应条件：预变性：95 ℃10 min；循环(40次)95 ℃15 s→60 ℃60 s；熔解曲线，65 ℃→95 ℃，每 15 s升温 0.3 ℃。在美国ABI7500荧光定量扩增仪上完成荧光实时监测PCR扩增，作出溶解曲线，收集荧光得到的曲线图，用实时荧光定量PCR分析程序分析。ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)，B=CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)，K=A-B(mean)，表达水平以 2-ΔΔCT表示。

表1 PCR引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 PCR分析结果

各组关节软组织中RANKL、RANK、OPG阳性表达的平均灰度值比较见表2。由表2可见，与空白组对比，模型组的RANKL、OPG mRNA表达明显上调(P<0.01)，与模型组相比，甲氨蝶呤组、熊果酸+甲氨蝶呤组中RANKL mRNA表达明显降低(P<0.01)，熊果酸高剂量组RANKL mRNA表达降低(P<0.05)；与甲氨蝶呤组比较，熊果酸+甲氨蝶呤组中RANKL mRNA表达降低(P<0.05)。

组别RANKRANKLOPG空白1.64±0.121.30±0.27◆◆1.66±0.14◆◆CIA模型组1.99±0.342.00±0.162.31±0.28熊果酸(UA50mg/kg)2.04±0.211.74±0.172.41±0.19熊果酸(UA100mg/kg)2.05±0.361.62±0.19◆2.22±0.20甲氨蝶呤(MTX)组2.11±0.151.58±0.09◆◆2.4±0.17UA+MTX组2.19±0.281.42±0.06◆◆△2.29±0.09

注：◆◆P<0.01，◆P<0.05，与模型组比较；△△P<0.01，△P<0.05，与MTX组比较。

3 讨论

RA的发病机制复杂，对RA的骨保护作用是防止RA关节损害新的研究重点。RA发病机制是由多种细胞及细胞因子共同作用的过程，其中，破骨细胞(osteoclast，OC)的繁殖及激活起着关键作用，RANKL/RANK/OPG通路通过对OC增殖过程的调控，从而影响骨保护作用[8]。OC来源于造血干细胞的多核细胞，能溶解骨组织，参与骨破坏。在破骨细胞前体(osteoclast precursors，OCPs)形成OC的过程中，要通过RANKL激活OCPs表面的 RANK受体，从而诱导OCPs形成 OC。RANKL不仅是OCPs分化的激活因子，还可通过刺激OC的繁殖和激活，抑制OC死亡[9]。OPG又叫破骨细胞抑制因子，是一种生长因子受体，能竞争性与RANKL联合，进而阻断RANKL与RANK的联络，减少OCPs向OC的增殖分化[10]。由此可见，RANKL和 OPG的稳定影响骨代谢，RANKL/OPG比值是骨骼完整性的重要要素[11]。研究表明，RANKL/OPG比率失衡是许多骨骼疾病的病理基础[12]。相关研究表明，局部病变RANK及OPG比值能影响以OC为介导基础的骨代谢的稳定，这提示RANKL/OPG比值在RA骨保护中有着重要的影响[13]。

在RA的诊疗中，急性疼痛期配合使用抗炎止痛药，系统诊疗过程包括抗风湿病药、生物制剂及手术等。中药治疗风湿病历史悠久，与单纯西药治疗RA相比，中药治疗RA在患者病情活动的控制及预后具有一定优势。协同中药诊治RA不仅能提高临床疗效，并可减轻部分西药的副作用。中药可能成为RA骨保护新的研究方向。本项目组前期研究发现，UA是一种有潜力的低毒且高效的生物制剂[14]。本实验研究了熊果酸对大鼠CIA模型关节软组织RANKL、RANK、OPG mRNA表达的影响，发现高剂量组的UA对CIA大鼠关节RANKL mRNA表达减低，与单用MTX组比较，UA联合MTX组大鼠关节RANKL mRNA的表达降低(P<0.05)。因此，UA联合MTX应用于大鼠关节炎，效果优于单独应用MTX，由于RANKL/OPG的激活有多种细胞因子参与，UA表现出来的对炎症关节组织中的RANKL的抑制作用，可能与早期缓解了关节炎症有关。