陈皮对幼龄大鼠厌食症的改善作用及机制研究*

袁 立，余金蓉，李 军，张欣雨，刘建国

1.湖北省应城市人民医院新生儿科(应城 432400)； 2.武汉科技大学附属孝感医院儿科(孝感 432000)

小儿厌食症 (Infantile anorexia,IA) 是一种儿科常见慢性消化功能紊乱综合征。IA主要症状是长期的食欲减退或消失、食量减少至原来的一半或者三分之一、持续时间达到两周以上[1]。IA多发于1～6岁小儿，占儿科就诊人数的5%～7%，该病还有逐年增加的趋势[2]。长期厌食会使儿童营养不良、形体消瘦、生长发育迟缓、免疫力下降、继发各种感染性疾病，甚至影响儿童的智力发展和心理健康，给家庭和社会带来极大负担[3]。该病的具体发病机制尚不明确，中医认为小儿多因喂养不当、饮食不节、情志失调等损伤脾胃，加之小儿“脾常不足”的生理特点，导致脾胃受纳和运化失调，从而引起厌食[4]。陈皮(Pericarpium cirri reticultae，PCR) 是芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，是中国传统药物。其味辛、苦，性温，入脾、肺经，具有“理气健脾，燥湿化痰”的功效[5]。且已有研究表明，陈皮能够促进胃排空和肠推进[6]，预示陈皮对小儿厌食具有良好改善作用。本文主要探讨陈皮对幼龄厌食大鼠的作用及机制，以期为陈皮开发利用及小儿厌食症的预防治疗提供参考数据。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：体重(60±10) g SD幼龄大鼠60只，雌雄各半，由四川大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(川)2018-026。

1.2 饲料：常规饲料由四川大学实验动物中心提供，特制饲料是按照1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2 的比例混合鱼肉松、奶粉、玉米粉、黄豆粉、白糖、鲜鸡蛋、鲜肥肉，通过自制圆柱状模具塑型，经烘箱烘干，4 ℃ 冷藏备用[7]。

1.3 药物与试剂：将精选陈皮粉碎水煎，制成100% 浓度水煎剂，由药检所中药室鉴定提取。胃动素、胃泌素和-内啡肽试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，RIPA裂解缓冲液购自南京海克尔生物科技有限公司， LEP抗体、NPY抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海艾博抗生物科技有限公司，BCA试剂盒购自海易色医疗科技有限公司。

2 治疗方法

2.1 实验分组：将SD大鼠随机分为对照组、模型组、三个给药组(陈皮低、中、高剂量组)，每组12只。

2.2 模型建立及给药：空白对照组饲喂常规饲料，模型组饲喂特制饲料，所有的大鼠在室温20 ℃～24 ℃、相对湿度50% 条件下，单笼饲养。在造模8 d后开始给药，对照组和模型组灌胃1 ml生理盐水，给药组大鼠每只分别灌胃1 ml 10、30、50 g/ml 的陈皮水煎剂，每天灌胃1次。第28天开始禁食，第29天腹主动脉采血、取胃等。

3 检测指标

3.1 摄食量和体重：通过称重法测定各组大鼠摄食量和体重。

3.2 胃蛋白酶活性：采用Mett法测定胃蛋白酶活性：实验当天将吸满鸡蛋清的毛细玻璃管(内径：2 mm，长10 cm)置于70 ℃热水使蛋白凝固，制成蛋白管。在试管中加入1 ml胃上清液和15 ml 0.05 mol/L的盐酸，放入2个蛋白管后封口，将其置于37 ℃恒温箱，24 h后测定四端透明长度。计算公式：胃蛋白酶活性单位(U/ml)=透明管长度均值2×16。

3.3 胃酸浓度：将胃液2 ml置于小烧杯中，分别加入3滴二甲基黄指示剂和酚酞指示剂，然后混合均匀。将0.02 mmol/L 氢氧化钠溶液用微量滴定管逐滴加入，边滴加边摇匀，颜色由樱红色变为橙黄色再变为微红色时为滴定终点。计算公式：总酸度(mmol/L)=终点量×10。

3.5 下丘脑中瘦素(Leptin，LEP)和神经肽Y(Neural peptide Y，NPY)蛋白的表达：将小丘脑组织匀浆，并用RIPA裂解液来提取组织的总蛋白，通过 BCA试剂盒检测蛋白的浓度；然后通过SDS凝胶电泳分离蛋白，用半干转膜仪将蛋白质转移至PVDF膜，并用脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h；再加入兔来源的单克隆一抗(LEP 1∶500、NPY 1∶1000、GAPDH 1∶1000)，在4 ℃ 封闭过夜；接着加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔单克隆二抗(1∶2000)室温封闭1 h；最后滴ECL曝光，以GAPDH为内参，使用Quantity One软件进行分析目标蛋白质的相对表达水平。

3.6 胃排空：第29天给各组一半的大鼠灌胃营养性半固体糊2 ml/只，40 min后，将大鼠麻醉，结扎并取胃。将胃表面清理干净并擦干后称取胃全重，清洗干净胃内容物并擦干后称取胃净重。计算公式：胃残留百分率=(胃全重-胃净重)/灌胃总量×100%。

结 果

1 陈皮对幼龄厌食症大鼠的摄食量和体重的影响 见表1、2。与对照组相比，模型组大鼠摄食量显著减少(P<0.01)，体重显著减少(P<0.01)，说明造模成功；与模型组相比，给药组大鼠摄食量显著增加(P<0.01)，体重显著增加(P<0.01)，且效果随着给药量的增加越显著，说明陈皮呈剂量依赖性促进幼龄厌食症大鼠的摄食量和体重的增加。

2 陈皮对幼龄厌食症大鼠的胃蛋白酶活性和胃酸分泌的影响 见表3。与对照组相比，模型组大鼠胃蛋白酶活性显著减弱(P<0.01)，胃酸分泌量显著减弱(P<0.01)；与模型组相比，给药组大鼠胃蛋白酶活性显著增强(P<0.01)，胃酸分泌量显著增强(P<0.01)，且效果随着给药量的增加越显著，说明陈皮呈剂量依赖性增强幼龄厌食症大鼠的胃蛋白酶活性和胃酸分泌。

表1 陈皮对幼龄厌食症大鼠摄食量的影响(g)

表2 陈皮对幼龄厌食症大鼠体重的影响(g)

表3 陈皮对幼龄厌食症大鼠胃蛋白酶活性和胃酸分泌的影响

4 陈皮对幼龄厌食症大鼠下丘脑中瘦素和神经肽Y蛋白的表达的影响 见表5。 与对照组相比，模型组大鼠下丘脑中瘦素明显上调、神经肽Y蛋白的表达明显下调(P<0.01)；与模型组相比，给药组大鼠下丘脑中瘦素明显下调、神经肽Y蛋白的表达明显上调(P<0.01)，且效果随着给药量的增加越显著，说明陈皮呈剂量依赖性上调幼龄厌食症大鼠下丘脑中瘦素和神经肽Y蛋白的表达。

表4 陈皮对幼龄厌食症大鼠血浆中胃动素、胃泌素、-内啡肽含量的影响(ng/ml)

表4 陈皮对幼龄厌食症大鼠血浆中胃动素、胃泌素、-内啡肽含量的影响(ng/ml)

组 别n胃动素 胃泌素 迳-内啡肽对照组120.35±0.0439.21±5.413.15±0.21模型组120.23±0.0325.67±4.982.18±0.23陈皮低剂量组120.33±0.0338.66±5.763.03±0.19陈皮中剂量组120.38±0.0439.86±5.373.11±0.24陈皮高剂量组120.42±0.0341.65±5.643.16±0.21

表5 陈皮对幼龄厌食症大鼠下丘脑中瘦素和神经肽Y蛋白的表达的影响

5 陈皮对幼龄厌食症大鼠胃排空的影响 见表6。与对照组相比，模型组大鼠胃残留物显著增多(P<0.01)；与模型组相比，给药组大鼠胃残留物显著减少(P<0.01)，且效果随着给药量的增加越显著，说明陈皮呈剂量依赖性促进幼龄厌食症大鼠胃排空。

表6 陈皮对幼龄厌食症大鼠胃排空的影响(%)

讨 论

食欲减退、体型消瘦是小儿厌食症的主要表现症状，有效的增强食欲是治疗小儿厌食的关键之一。本文通过研究发现，陈皮呈剂量依赖性促进幼龄厌食症大鼠的摄食量和体重的增加，预示陈皮对厌食症具有良好的改善效果。

胃蛋白酶是一种由胃粘膜主细胞所分泌的能将食物中的蛋白质分解为小肽片段的消化性蛋白酶，其活性和胃的消化功能息息相关[8]。胃酸是胃液中分泌的盐酸。如果胃酸分泌不足，则其无法担负起消化及防腐制酵的工作，这将会影响消化吸收功能，并导致营养物质消化和吸收的障碍[9]。吴丽萍等[10]发现小儿增食灵合剂治疗小儿厌食症的作用机制可能与其有效地增加胃游离酸及总酸度、提高胃蛋白酶的活性，从而达到促进消化的作用有关；加减益胃汤对脾胃阴虚小儿厌食症的治疗作用与能显著促进小鼠胃排空和小肠推进功能，明显提高厌食症模型大鼠胃蛋白酶活性，调节胃酸分泌有关[11]；因此，有效的提高胃蛋白酶活性和胃酸的分泌量有助于小儿厌食症的临床治疗。本文通过研究发现，陈皮呈剂量依赖性增强幼龄厌食症大鼠的胃蛋白酶活性和增加胃酸分泌量，着有助于改善厌食症病症。

胃动素是一种影响胃及肠道的动力，诱发胃强烈收缩和小肠明显的分节运动，加强回肠和结肠的运动，对胃肠腔内容起清扫作用的脑肠肽激素[12]。胃动素属于消化间期激素，还刺激胃蛋白酶、胰液的分泌，有助于食物消化[13]。因此，可以用血浆中胃动素的含量来反映胃肠道的运动和功能状态。易燕等发现扶正健脾汤改善厌食症患儿临床症状，调节食欲因子，促进胃动素的正常分泌，增强食欲[14]。本文通过研究可知，陈皮呈剂量依赖性增加幼龄厌食症大鼠的血浆中胃动素含量，有助于改善厌食症病症。胃泌素是一种主要由G细胞分泌的胃肠激素，几乎对整个胃肠道均有作用，可促进胃肠道的分泌功能，促进胃窦，胃体收缩，增加胃肠道的运动[15]。厌食症患者血清胃泌素水平的降低，提示胃泌素浓度的降低可能是影响进食的病理抑制因素之一[16]。二宝颗粒可通过直接或间接调节胃窦胃泌素分泌，增加厌食症模型的供食量[15]。本文通过研究发现陈皮呈剂量依赖性增加幼龄厌食症大鼠的血浆中胃泌素含量，有助于改善厌食症病症。

LEP和NPY在饮食维持和调节中具有重要作用。LEP作为食欲的调节因子，具有抑制食欲产生的作用。本文研究发现陈皮呈剂量依赖性下调大鼠下丘脑中瘦素、上调神经肽Y，通过神经中枢调节因子影响食欲，良好改善厌食症病症。胃排空指食物由胃排入十二指肠的过程。促进动物胃排空会使动物有空腹感并促进食欲，改善厌食的情况。已有研究表明陈皮促进胃排空[6]，这与本文研究结果陈皮呈剂量依赖性促进幼龄厌食症大鼠胃排空相一致。

综上所述，陈皮呈剂量依赖性增强胃蛋白酶活性，增多胃酸分泌量及血浆中胃动素含量、胃泌素含量、-内啡肽含量，下调调下丘脑中瘦素、上调神经肽Y，并促进胃排空，对改善幼龄厌食大鼠具有改善调节的作用。这为中药材陈皮的开发利用提供依据，为小儿厌食症的治疗提供参考数据，具体分子机制还有待进一步的研究。