荧光光谱法考察β-环糊精-洛伐他汀包合性能

温福丽，王松涛，2，何 诚，，彭远松，宋 川

（1.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000；2.泸州品创科技有限公司，四川泸州 646000；3.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000）

环糊精（cyclodextrins,CDs）是由α-1,4-糖苷键连接多个D（+）-葡萄糖单元形成的中空的环麦芽七糖环状化合物，是从淀粉中水解得到的一类寡糖，也是一类资源丰富的天然低聚物。外侧的C2、C3形成的仲羟基及C6构成的伯羟基使得环糊精具有一定的亲水性，内部的空腔则由于C-H 键的屏蔽作用而具有疏水性。环糊精在超分子化学中较为广知的是最有效的主体[1-2]；包合物的形成受客体的理化性质影响较大；比如分子大小、空间结构、电荷状态以及分子极性等因素[3]。在食品应用中，环糊精包合一些热不稳定、难溶物质的应用较多[4-6]，β-环糊精由于其廉价、具有适中的空腔尺寸且价格低廉应用最为广泛。

红曲酒作为我国华中、华东等地区流行的一种传统名酒，含有较为丰富的洛伐他汀（图1），具有较高的营养价值。红曲菌在发酵过程中能代谢产生γ-氨基丁酸、洛伐他汀、麦角固醇等多种有益物质[7]，功能性红曲主要成分洛伐他汀（Lovastatin，也称莫那克林K,Monacolin K,MK）是红曲霉生成的次级代谢产物之一。洛伐他汀作为一种真菌代谢的天然他汀，在临床上可作为Hmg-CoA 还原酶的竞争性抑制剂，能有效阻断人体中的内源性胆固醇的合成，本身也能够促进胆固醇的分解，具有较好的降脂功效，且无不良反应等作用[8-13]；课题组前期研究表明，洛伐他汀在红曲酒中能带来一定的苦涩味，我们期望借助环糊精的微胶囊作用将洛伐他汀的苦涩味掩盖，改善其食用可接受性。

本实验采用共沉淀法制备了β-CD-MK 包合物，借助荧光增强法和高效液相法进行了表征验证。荧光光谱法研究了β-CD 与MK 的主客体包合比、包合常数及热力学常数并对包埋工艺进行了初步考察；对比高效液相法和荧光增强法的方法学考察，得知两种方法都能较好的测定洛伐他汀的含量（RSD≤5 %），而荧光光谱法可更灵敏表征β-CDMK 包合物的包合性能，为后期更好地开发口感良好、稳定性更佳的红曲酒提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

耗材及试剂：洛伐他汀（Monacolin K）标品（99.1%上海安谱试剂，CDAA-280812-20 mg）；β-环糊精（Sigma-Aldrich，St.Louis,MI,USA）；盐酸（36.5 %,AR 级，成都科龙化工试剂厂）；Na2HPO4（AR 级，成都科龙化工试剂厂）；甲醇/乙醇（色谱级，德国Meker 公司）；乙酸（色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司）；二次蒸馏水。

仪器设备：日立HITACHI F-7000；岛津2010高效液相；紫外SP-756P；METTLER TOLEDO电子天平；DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂制备

洛伐他汀标液：准确称取20.00 mg 试样于25.00 mL 容量瓶中，乙醇（75 %vol）溶解后定容配制成0.80 mg/mL的MK溶液。

β-环糊精溶液：称取干燥的β-环糊精1.1350 g用水溶解后定容至100 mL 容量瓶中，配制成10.00 mmol/L β-环糊精溶液。

缓冲溶液：pH7.0的缓冲液：24.40 mL的0.10 mol/L HCl和75.60 mL的0.10 mol/L Na2HPO4[14]。

1.2.2 β-CD-MK包合物的制备[15]

取新鲜配制的MK 20 mg 用少量75%vol 乙醇溶解后和环糊精以物质的量1∶5 配制：将洛伐他汀溶液缓慢加入到环糊精溶液中，磁力搅拌48 h，放入冰箱24 h 后，用0.45 μm 的滤膜过滤（在文献[15]的基础上改进），取滤饼常温干燥后得白色固体包合物及未被包合的液体部分，包合物于4 ℃干燥器中保存备用。

1.2.3 高效液相表征方法及洛伐他汀标曲获取

新鲜配制MK 用75 %vol 乙醇定容至25 mL，分别取20 μL、60 μL、100 μL、140 μL、180 μL MK标液，甲醇定容至5 mL,0.45 nm膜过滤，进样10 μL；检测器：UV（最佳吸收波长238 nm）；高效液相条件（参照QB/T 2847—2007）：HPLC 条件：v=0.65 mL/min，T=45 ℃，流动相：甲醇∶水∶乙酸=385∶115∶0.14；绘制标准曲线，数据拟合获得标准曲线的线性回归。取1.2.2 未被包合的上清液测定β-CD-MK 包合物体系的含量，计算包合率。

1.2.4 荧光光谱法获取λEX/λEM

在10 mL容量瓶中，依次加入MK标准溶液40 μL，环糊精标准液2.00 mL，2.00 mL 缓冲液，用水定容至刻度，25 ℃恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min 后，在激发波长200～400 nm，发射波长250～500 nm范围内进行光谱扫描，扫描速度1200 nm/min，EM sampling：1 nm，EX sampling：5 nm，response：0.5 s，EX/EM=5.0 nm，PMT voltage：700 V，获取包合物的最大发射波长λEM=333 nm 和激发波长λEX=225 nm。

1.2.5 荧光光谱法表征

设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围分别测定β-CD、MK、以及包合体系的荧光发射谱，比较分析光谱特征，获得包合体系的荧光表征图。

1.2.6 荧光光谱法制备β-CD-MK体系标曲

新鲜配制MK 用75 %vol 乙醇定容至25 mL，分别取20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL MK标准容液，加入2.00 mL β-CD环糊精标准容液、2.00 mL缓冲液，用水定容至10 mL，25 ℃恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min 后，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围分别测定F 值。绘制标准曲线，数据拟合获得标准曲线的线性回归。取1.2.2 未被包合的上清液测定β-CD-MK 包合物体系的含量，计算包合率。

1.2.7 荧光光谱法考察缓冲液体积对β-CD-MK体系的影响

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 标准溶液40 μL，环糊精标准液2.00 mL，加入缓冲液体积：0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL，用水定容至刻度，25 ℃恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min 后，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm范围分别测定F值。

1.2.8 荧光光谱法考察温度对β-CD-MK 体系的影响

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 标准溶液40 μL，环糊精标准液2.00 mL，加入缓冲液体积2.00 mL，用水定容至刻度，在温度为5 ℃、25 ℃、45 ℃、65 ℃、85 ℃下恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min后，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围分别测定F值。

1.2.9 荧光光谱法考察时间对β-CD-MK 体系的影响

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 标准溶液40 μL，环糊精标准液2.00 mL，加入缓冲液体积2.00 mL，用水定容至刻度，在温度25 ℃下恒温加热磁力搅拌器搅拌0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 后，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm范围分别测定F值。

1.3 包合反应比及热力学常数的测定

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 标准溶液40 μL，环糊精标准液：0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL 缓冲液，用水定容至刻度，25 ℃/45 ℃/65 ℃恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min 后，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围分别测定F 值；按照Benesi-Hilderbrand 方程计算包合比及热力学常数。

1.4 包合率计算

分别用高效液相法和荧光光谱法所得标准曲线测定包合液上清液中洛伐他汀的含量，计算包合率。

式中：m1为包合液上清液MK 含量；m为客体MK的含量。

2 结果与分析

2.1 高效液相法和荧光光谱法分析

分别将β-CD、MK 标液以及包合物体系在波长250～500 nm 进样，根据高效液相检测器窗口可知：MK 及其饱和体系的最大吸收波长λ=238 nm 且在此波长范围内β-CD 几乎无紫外吸收，故选λ=238 nm 作为检测波长，这也与QB/T 2847—2007 建议匹配。结果表明，MK 溶液在pH7 时λ=238 nm 处有最大吸收峰，当加入β-CD 溶液时，最大吸收峰位置不变，同时包合物体溶液的紫外吸收峰明显高于β-CD 和MK 溶液本身，表明发生了明显的包合作用[16]。

设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围分别测定β-CD、MK、以及包合体系的荧光发射谱，结果见图2。结果表明，当β-CD 加入MK 溶液后，最大发射波长并没有改变，但荧光强度值明显增强。分析原因可能是因为MK 分子以非共价键范德华力和氢键结合β-CD 的疏水空腔，在空腔中，MK分子的运动自由度降低，屏蔽了MK溶液的荧光信号。因此荧光强度的增加可以证明包合物的形成[16]。

2.2 方法学考察

取1.2.2 包合物的上清液分别用高效液相法和荧光光谱增强法考察包合率，并进行方法学考察。

2.2.1 线性考察及灵敏度

以3 倍信噪比为检出限，10 倍信噪比为定量限进行仪器检测，高效液相法所获取MK 标曲：S=46156.24C+34274.43（R2=0.9990，定量限0.45μg/mL，检测限1.45 μg/mL）；在MK 浓度范围3.20～28.80 μg/mL 内线性范围较好；荧光光谱增强法所获取MK 标曲：F=39020.58C+399.83（R2=0.9962，定量限0.24 μg/mL，检测限0.98 μg/mL），在MK 浓度范围1.62～8.10 μg/mL内线性范围良好，见表1。

2.2.2 精密度试验

高效液相法：准确量取包合物上清液400 μL，用甲醇定容至5 mL，0.45 nm 膜过滤，进样10 μL，重复进样3 次，根据高效液相标准曲线方程求得包合率平均值为60.50 %，RSD 为1.72 %。荧光光谱法考察精密度：准确量取包合物上清液200 μL，加入2.00 mL β-环糊精，2.00 mL 缓冲液加水定容至10 mL，在25 ℃下反应15 min 后测量荧光值F，重复测量6 次，根据荧光光谱法标准曲线方程求得包合率平均值为46.73 %，RSD 为4.28 %。详细数据见表2。

2.2.3 稳定性试验和重复性试验

按照2.2.2 方法，取同一份样品，分别于0、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h 时分别测量获得相应的峰面积值和荧光值，每组测6 次并计算相对标准偏差。结果显示，高效液相法计算所得相对标准偏差为1.69 %，荧光光谱法计算所得相对标准偏差4.58%。

表1 线性方程及灵敏度

表2 精密度试验结果

表3 加标回收率试验结果

取同一批样品6 份，按照2.2.1 方法，测量获得相应的峰面积值和荧光值并计算相对标准偏差。结果显示，高效液相法计算所得相对标准偏差为1.73 %，荧光光谱法计算所得相对标准偏差4.83%。

2.2.4 回收率试验

按照2.2.2 方法考察洛伐他汀的加标回收率与相对标准偏差，样品加入量为上清液含量的80%、100%、120%加入考察，详细结果见表3。

方法学考察说明：根据《中国药典》2015 版总则中对物质含量测定和QB/T 2847—2007 中对功能性红曲米（粉）的含量测定要求，高效液相法的RSD 均小于2 %，说明方法的精密性、重复性均良好，样品在24 h 内保持稳定；针对荧光光谱法暂时没有相应法规要求，但是该实验结果符合QB/T 2847—2007 中RSD≤±5%的要求，可见两种方法的结果都准确可靠，适用于研究结果的确定及对产品的质量分析、评价。

2.3 荧光光谱法参数优化

2.3.1 缓冲液体积的优化

通过对包合体系缓冲液体积加入量的考察，在25 ℃恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围分别测定F值。由此得知，随着缓冲液的加入，当加入量为2.00 mL 之后，荧光强度值变化不大，因此我们选择加入缓冲液体积2.00 mL 作为实验测定值，参见图3。

2.3.2 温度对包合物的影响

通过对包合体系反应温度的考察，在5～85 ℃的范围内加热磁力搅拌器搅拌15 min，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围分别测定F值，由此得知，高温情况下进行包合时荧光强度值低于低温下的荧光强度值，反应可能是一个放热反应，因此我们选择在室温即25 ℃作为实验测定值，参见图4。

2.3.3 时间对包合物的影响

通过对包合体系时间的考察：在25 ℃恒温加热磁力搅拌器搅拌，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围内，每隔5 min 测定F 值，由此得知，当反应时间到达10 min 时，荧光强度值变化不大，反应达到15 min 后趋于稳定，因此我们选择反应15 min作为实验测定值，参见图5。

2.3.4 β-环糊精浓度对包合物的影响

通过对β-CD 体积的考察：在25 ℃恒温加热磁力搅拌器搅拌15 min，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围内分别测定F 值。由此得知，β-CD 体积越大，荧光强度值越大，因此我们选择2.00 mL的加入量作为实验测定值，参见图6。

2.4 荧光光谱法β-CD-MK 包合比及包合常数计算[17]

根据2.3.4 的结果，设定EX=225 nm，在发射波长250～500 nm 范围内分别测定F 值，在β-CD 的量远远大于洛伐他汀的情况下，根据Benesi-Hildebrand 的双倒数法得包合物的包合常数K，根据拟合情况对包合比进行判断。假设β-环糊精和洛伐他汀的包合比为n，即MK+[β-CD]n→(β-CD)n-MK，则包合物的包合常数K=[(β-CD)n-MK]/（[MK]×[(β-CD)n]），式中，[MK]、[ β-CD]、[β-CDMK]分别为客体MK，主体β-CD和β-CD-MK的平衡浓度。根据Benesi-Hildebrand 的双倒数法得：

式中：F 为不同浓度β-CD 的荧光强度，F0为不加入β-CD 时的荧光强度，F∞为包合物的荧光强度。

将实验数据以1/(F-F0)分别对1/[β-CD]和1/[β-CD]n作图（n=1,2,3），如果得到线性关系较好的直线则说明其对应的包合比为相应的n 值。当n=1时，F=0.0026c+0.0014（R2=0.9991，n=1,T=25 ℃）；当n=2 时，F=0.0010c+0.0026（R2=0.9654，n=2,T=25 ℃）；F=0.0026c+0.0014（R2=0.9228，n=3，T=25 ℃），β-CD-MK 的双倒数曲线见图7，根据拟合情况看，1/(F-F0)和1/[β-CD]n的拟合在n=1 时，呈现较好的线性关系。由此可以确定β-环糊精和洛伐他汀的包合比为1∶1。由斜率和截距计算求得包合常数K=538.50 L/mol，说明β-CD 与MK 形成的包合物较为稳定。且温度越高，包合常数K 值越小，说明该反应在较低温条件下更稳定。

在上述基础上，改变反应温度，得到不同温度下的反应包合常数，见图8和表4。

2.5 荧光光谱法β-CD-MK热力学参数的计算[18]

标准状况下，Gibbs 自由能G，焓H，熵值S 有如下关系：

表4 不同温度下包合物的结合常数

由Van't Hoff等温式可得：标准状态下，有ΔG°=ΔH°-TΔS°，由Van' t Hoff 等温式可得：ΔG°=-RT ln K，则有：ln K=-ΔH°/RT+ΔS°/R，以lnK 对1/K 作图，由斜率和截距求得ΔH 和ΔS，具体结果见表5，其中，R=8.314×10-3KJ/mol·K。由表5 可知，包合反应的ΔH＜0，ΔS＜0，说明反应为放热反应，熵增过程；ΔG＜0 且随着温度的升高，反应负值减小，说明温度较低更有利于实验的自发反应。

表5 包合物的热力学常数

3 结论

通过荧光光谱法研究了β-环糊精和洛伐他汀之间的相互作用，结果显示，β-环糊精和洛伐他汀以1∶1 的包合比，包合常数K=538.50 L/mol，且该反应是一个放热自发反应，为后期开发红曲酒的包埋工艺提供了理论依据。利用经典的荧光增强法来研究β-环糊精与客体分子的包合作用越来越普遍：因为该方法所需要的试剂相比高效液相法等更为安全，且所需样品浓度更低。本次实验中，借用环糊精的荧光增强作用，一个简单、快速且灵敏度高的用于测定洛伐他汀含量的方法被开发，对比传统的高效液相法两种方法的结果都具有一定的可靠性，且荧光光谱法操作简单，试剂危害小，未来的发展空间会更大，为后期检验包埋情况及含量检测提供技术支持。