白藜芦醇对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用

汪 雷 胡火军 马金阳 董元训 黄 松 符常涛 袁 高 周有东

脑血管病病人继发脑功能障碍往往是神经元凋亡和脑微循环损伤的结果[1]。静脉纤溶酶原激活剂是治疗急性缺血性脑卒中唯一有效的药物[2]，但治疗时间窗短，还有潜在的出血风险，只有一小部分病人获益[3]。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种多酚类植物抗毒素，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗癌作用，能透过血脑屏障并发挥神经保护作用[4，5]。有研究报道Res 可以通过介导磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB 或Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路发挥神经保护作用[6]。本研究通过建立大鼠大脑中动脉阻塞缺血后再灌注模型，探讨Res 对大鼠脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）损伤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 试剂2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）购自中国医药上海化学试剂公司，Res和3-MA均购自美国Sigma公司，PCR试剂盒购自南京Vazyme 公司。兔多抗mTOR 及PmTOR（289 KD）购自美国Affinity Biosciences 公司，兔单抗Akt 及P-Akt（60 KD）均购自美国Cell Signaling 公司，鼠单抗PI3K（85 KD）购自武汉三鹰生物技术有限公司，兔多抗p-PI3K（85KD）购自美国Abcam公司，HRP 标记的羊抗小鼠和羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司，兔多抗GAPDH（37 KD）购自杭州贤至生物有限公司。

1.2 实验动物及分组SPF级雄性SD大鼠80只，7周龄，体重（250±30）g，由武汉大学动物实验中心提供（合格证编号：SCXK 鄂2016-0004）。大鼠适应性喂养7 d后，随机分为假手术组、模型组、Res组和Res+PI3K 抑制剂组，每组20只。

1.3 模型建立和干预 参照Yanamoto等[7]报道的线栓法制备大脑中动脉栓塞模型，缺血2 h，再灌注24 h。造模前6 d，Res 组和Res+PI3K 抑制剂组腹腔注射Res（15 μg/g，1次/d），假手术组和模型组腹腔注射等体积生理盐水；造模前30 min，Res 组和Res+PI3K抑制剂组先腹腔注射Res（15 μg/g），然后，Res+PI3K组用微量注射器向右侧脑室（前囟点旁开1.6 mm，向后0.9 mm，腔深3.8mm）注射PI3K 抑制剂3-MA 5 μl（50 μg），假手术组和模型组右侧脑室注射等体积生理盐水。

1.4 神经功能评估 造模后21 h，采用Zea Longa评分评估神经功能[8]。

1.5 脑梗死体积的评估 造模后24 h，每组随机选取4 只大鼠行TTC 染色评估脑梗死体积。麻醉处死大鼠后，取鼠脑置于-20度冰箱冷冻20 min后，取出切片，层厚2 mm[9]。然后，将脑片置于2%TTC 溶液中孵育，完全显色后将其移入4%多聚甲醛中过夜固定后拍片。为避免因脑水肿产生数据误差，我们采用梗死面积比[（对侧半球面积-患侧正常脑组织面积）/对侧半球面积]描述脑梗死程度。

1.6 尼氏染色观察脑组织尼氏体形态 术后24 h，每组随机选取4 只大鼠以10%水合氯醛麻醉，用生理盐水和4%多聚甲醛行心脏灌注和组织固定，然后取鼠脑置于4%多聚甲醛中固定48 h，经石蜡包埋、组织切片、脱蜡后，再行1%的甲苯胺蓝染色，95%酒精快速分化，脱色，无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，尼氏染色，显微镜下观察。

1.7 透射电子显微镜观察自噬体形态 术后24 h，每组随机选取4 只大鼠以10%水合氯醛麻醉，采用0.9%生理盐水250 ml 心脏灌注后，再用4%多聚甲醛+2.5%戊二醛混合液250ml 快速灌注固定，然后，快速分离右侧半球额顶区皮质，大小约1 mm3，以预冷的2%多聚甲醛和2.5%戍二醛的PBS 混合液4 ℃固定过夜。再用四氧化锇固定1 h，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片（厚度100 nm），并用乙酸铀和柠檬酸铅染色，最后在透射电子显微镜下观察。

1.8 PCR 检测脑组织自噬及凋亡相关基因转录水平设计并合成大鼠Beclin1及GAPDH基因（内参照）的PCR引物。术后24 h，每组随机选取4只大鼠并收集脑缺血周边区组织约50 mg，分别提取其总RNA 并予以定量检测。采用逆转录试剂盒（南京Vazyme公司）将RNA逆转录为cDNA，按其试剂盒操作说明进行PCR 检测，以2-ΔΔCt法进行量化分析。beclin1正义链5'-GAGGTACCGACTTGTTCCCT-3'，反义链5'-CCTTTCTCCACGTCCATCCT-3'。内参GAPDH 正义链5'- ACAGCAACAGGGTGGTGGAC- 3'，5'- TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

1.9 免疫印迹法检测mTOR、PI3K、Akt及相应磷酸化水平 术后24 h，每组随机选取4 只大鼠并分离脑缺血周边区组织，提取各组织总蛋白，SDS-PAGE分离各蛋白后转移到PVDF 膜上。将Akt（1:1 000），p-Akt（1:2 000），PI3K（1:4 000），p-PI3K（1:600），mTOR（1:1 000），p-mTOR（1:1 000）相应一抗分别放入封闭液（5%的脱脂奶粉的TBST 溶液）中，4°C 孵育过夜，分别加入辣根过氧化物酶标记二抗（1:50 000），室温孵2h,最后用增强化学发光显色，以GAPDH作内参。1.10 统计学分析 采用SPSS 18.0 进行分析；定量数据以±s 表示，用单因素方差分析；P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 模型组Zea Longa评分[（3.09±0.19）分]明显高于假手术组[（0.19±0.16）分；P＜0.05]；与模型组比较，Res 组Zea Longa 评分[（1.95±0.24）分]和Res+PI3K 抑制剂组Zea Longa 评分[（2.66±0.22）分]均明显降低（PP＜0.05），而Res 组和Res+PI3K 抑制剂组之间无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较 假手术组大鼠脑组织未见梗死灶；模型组、Res组和Res+PI3K抑制剂组大鼠右侧大脑半球皮层和皮层下可见明显白色梗死灶，左侧大脑半球脑组织呈正常红色。Res 组和Res+PI3K 抑制剂组脑梗死体积均明显小于模型组（P＜0.05），而且Res+PI3K 抑制剂组脑梗死体积较Res组明显增大（P＜0.05）。见图1。

2.3 各组脑组织尼氏体形态比较 与假手术组相比，模型组尼氏体明显减少，而且染色加深，形状不规则。与模型组比较，Res 组和Res+PI3K 抑制剂组尼氏体数量则明显增加；与Res组比较，Res+PI3K抑制剂组尼氏体数量则相对减少。见图2。

2.4 各组脑组织自噬体形态比较 假手术组大鼠脑组织细胞质中线粒体、内质网、核糖体等结构清晰，未见明显自噬泡；模型组可见明显细胞核固缩、碎裂、深染，胞膜轮廓不清，胞质疏松，可见大量空泡和液化灶，同时可见线粒体肿胀变形，线粒体嵴断裂；Res 组细胞形态结构基本正常，可见细胞质中线粒体、内质网、和双层膜自噬体等；Res+PI3K抑制剂组可见少量自噬体和其他细胞器。见图3。

2.5 各组脑组织自噬相关基因转录水平比较 与假手术组相比，模型组Beclin1 mRNA 水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，Res组和Res+PI3K抑制剂组Beclin1 mRNA 水平明显增高（P＜0.05）；与Res 组相比，Res+PI3K抑制剂组Beclin1 mRNA水平明显降低（P＜0.05）。见图4。

2.6 各组脑组织自噬相关蛋白表达及其磷酸化水平比较 与假手术组相比，模型组PI3K、mTOR和Akt蛋白表达水平无显著差异（P＞0.05），而各自蛋白磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）；相比于模型组，Res 组和Res+PI3K 抑制剂组PI3K、mTOR 和Akt 蛋白磷酸化水平明显下降（P＜0.05）；和Res 组相比，Res+PI3K抑制剂组PI3K、mTOR和Akt蛋白磷酸化水平明显增加（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

本研究探讨Res 对大鼠脑I/R 损伤的神经保护作用，结果发现，Res 可明显改善脑I/R 损伤大鼠的神经功能，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路，促进细胞自噬有关。细胞自噬是一种细胞内的自消化途径，负责清除长寿蛋白、受损的细胞器和在溶酶体生物合成中形成的畸形蛋白[10]。自噬是真核细胞降解和再循环胞质内容物的主要细胞保护途径，对机体维持稳态起着重要的作用，适度的自噬可抑制炎症及凋亡[11]。生理条件下，自噬被触发以维持体内平衡功能，并在营养缺乏或应激（如I/R损伤）时上调，以提供氨基酸和产生能量。在病理生理条件下，自噬功能障碍的特点是不能清除受损的细胞器或碎片[12]。对I/R损伤后组织自噬的研究表明，受损线粒体的累积导致活性氧生成增加，促进细胞坏死和组织损伤[13]。因此，改善脑组织对I/R损伤的自噬反应可以降低细胞凋亡和坏死水平，保护组织功能。

PI3K/Akt/mTOR 信号通路是促进缺血神经细胞修复和生存的重要信号通路，而且与细胞自噬的激活紧密相关[14]。本研究发现，Res组大鼠神经元内可观察到自噬体，同时Res 组大鼠脑内自噬相关基因Beclin1 mRNA 表达水平也明显增高，表明Res 通过促进脑I/R 诱导的自噬水平，从而促进神经元存活；免疫印迹法检测结果显示Res 能显著下调脑I/R 损伤大鼠脑组织p-PI3K、p-Akt、p-MTOR 水平，而PI3K 抑制剂3-MA 能够削弱Res 的作用。这表明Res 的自噬促进作用可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路来实现的。

综上所述，Res 可以改善大鼠脑组织I/R 损伤，可能与下调PI3K、Akt、mTOR等蛋白磷酸化水平、抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路、调控细胞自噬水平有关。