酒制对四物汤化学成分的影响研究

温慧娇，沈 群

(南方医科大学 中医药学院，广东 广州 510515)

中药炮制和复方配伍是中医用药的两大特色。目前，关于单味中药炮制机理的研究较多，却少有将炮制和复方进行整合研究，系统地阐明炮制对复方中药效的影响及其物质基础。脱离复方的单味中药炮制研究，难以反映炮制在复方中的作用，如有研究[1-3]表明：地黄生熟异用对四物汤的免疫功能、抗过敏作用和增强家蚕寿命的影响均有显著性差异，但为什么会影响这些功能变化，物质基础发生了什么改变等不得而知。因此，有必要探索炮制对复方化学成分影响的研究。

四物汤为临床补血、活血、调经的经典名方，最早记载于唐蔺道人著的《仙授理伤续断秘方》[4]：“凡伤重，肠内有瘀血者用此，白芍药、当归、熟地黄、川芎各等分，每服三钱，水一盏半。”我国第一部成药制剂规范宋《太平惠民和剂局方》中记载[5]：“当归(去芦，酒浸，炒)、川芎、白芍药、熟干地黄(酒洒蒸)，各等分。”继续查阅明《医方考》[6]、《仁术便览》[7]等则均显示四物汤中的当归(酒洗)、白芍(酒炒)需要经过酒制处理。现代研究[8]证实，川芎、当归酒制后都能增强活血行气止痛的功效；酒白芍比生白芍更善于柔肝止痛、调经止血，因此酒制处理四物汤复方中的白芍、川芎和当归可能更加适合四物汤的补血活血调经作用。

本文以白芍中的芍药苷、当归和川芎中的阿魏酸，熟地黄中的5-羟甲基糠醛(5-HMF)作为主要研究指标，从化学成分的含量变化来探讨酒制对四物汤复方中化学成分的影响，为研究中药炮制与复方的关系提供实验依据。

1 材料与试剂

1.1 仪器

超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-100)；超高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；安捷伦1290高效液相色谱仪。

1.2 试药

试剂：乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；磷酸(广州市金华大化学有限公司，分析纯)。

对照品：芍药苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；阿魏酸(上海源叶生物科技有限公司)；5-羟甲基糠醛(柏吉生物科技有限公司)。

中药饮片：熟地黄(批号：S7518316)、当归(批号：S7518316)、川芎(批号：C4518911)、白芍(批号：B4118311)，均来自广东省药材公司中药饮片厂。

2 方法与结果

2.1 指标成分的检测方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Ecosil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.5%磷酸水(B)，流速：1 mL/min，进样量：8 μL，梯度洗脱程序见表1。5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸最大吸收波长分别为284 nm、232 nm、324 nm，变检测波长程序见表2。

表1 梯度洗脱的程序

表2 变检测波长的程序

2.1.2 混合对照品溶液制备 精密称定适量对照品5-羟甲基糠醛、阿魏酸、芍药苷，用50%甲醇定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.1.3 供试品溶液制备 生当归、生川芎、生白芍饮片分别打粉，过20目筛，熟地剪碎。精密称定各2.5 g置于锥形瓶中，准确量取50%甲醇溶液100 mL加入锥形瓶，用封口膜封口，称重，超声(功率：100 KW；频率：40 KHz)提取1 h，冷却至室温，称重并用50%甲醇补足重量，摇匀。取适量提取液离心，转速8 000 r/min，时间5 min。取适量上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。

2.1.4 阴性对照溶液制备 取对应的饮片各2.5 g，按照“2.1.3”项下超声提取法处理，分别制备缺熟地、川芎、白芍、当归与川芎的阴性对照溶液a、b、c、d，备用。

2.1.5 线性与范围 取适量混合对照品溶液进样分析，以进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，得到工作曲线和范围，见表3。

表3 对照品的工作曲线和范围

2.1.6 精密度 精密吸取混合对照品溶液适量，连续进样6次，5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸的峰面积RSD值分别为0.25%、0.18%、0.74%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重现性 按照“2.1.3”项下超声提取法处理得到6份供试品进样分析，5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸的峰面积RSD值分别为1.10%、2.70%、1.38%，表明方法重现性良好。

2.1.8 稳定性 取上述供试品溶液，在放置0、4、8、12、16h后分别进样测定，记录各待测成分色谱峰的峰面积，5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸的RSD值分别为2.70%、0.77%、0.39%，表明供试品溶液在16h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率 分别精密吸取己知含量的供试品溶液适量，共18份，精密添加芍药苷、阿魏酸、5-羟甲基糠醛对照品溶液，定容至5mL容量瓶中，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。数据见表4。

表4 加样回收率数据

2.2 炮制品制备

按照《中国药典》酒制要求，取生当归、生川芎、生白芍饮片分别大小分档，加入黄酒(每100 kg加入1.5 kg)拌匀，稍闷润，待黄酒被吸尽，置预热好的炒制容器内，文火加热，炒至深黄色，取出放凉，分别为酒当归、酒川芎、酒白芍。

2.3 正交试验设计

选取白芍、当归、川芎作为实验因素，分别用A、B、C表示；每个因素的生品或酒制品作为两水平，用1、2表示。熟地作为炮制品，不作为因素研究。正交设计见表5。

表5 L4(23)正交设计

按照表5进行实验，以2号为例：精密称定熟地、生白芍、酒当归、酒川芎各2.5 g置于锥形瓶中，按照“2.1.3”项下供试品溶液的制备方法处理，以此类推，每号实验重复1次，制备各组样品溶液。

2.4 样品含量测定

混合对照品、供试品、阴性对照溶液按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，色谱图见图1、图2、图3。可见5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸各自的色谱峰分离度R>1.5，且三者的响应没有受到干扰组分的影响。

(1：5-羟甲基糠醛；2：芍药苷；3：阿魏酸)

(1：5-羟甲基糠醛；2：芍药苷；3：阿魏酸)

阴性对照a(缺熟地)、阴性对照b(缺川芎)、阴性对照c(缺白芍)、阴性对照d(缺当归与川芎)(1：5-羟甲基糠醛；2：芍药苷；3：阿魏酸)

按照“2.1.1”项下色谱条件测定正交试验设计制备的各组样品溶液中的5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸的含量，具体数据及直观分析见表6，方差分析结果见表7。可见复方中阿魏酸的含量变化有显著性差异。

2.5 对比验证实验

2.5.1 生白芍组溶液的制备 精密称定熟地、当归、白芍、川芎各2.5 g，置于锥形瓶中，精密吸取50%甲醇100 mL，密塞，称重，超声处理(功率100 W，频率40 kHz)1 h，放冷，再称重并补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。平行3份。

表6 正交试验数据

表7 正交试验结果方差分析

注：F0.01(1，4)=21.2，F0.05(1，4)=7.71，**表示有极显著差异。

2.5.2 酒白芍组溶液的制备 精密称定熟地、当归、酒白芍、川芎各2.5 g，其余与生白芍组溶液的制备方法一致，制成酒白芍组溶液，平行3份。

分别精密吸取生白芍组溶液和酒白芍组溶液注入液相色谱仪，测定各组的阿魏酸含量，具体数据与处理结果见表8。可见酒制白芍确实提升了复方中阿魏酸的含量。

组别123平均值标准偏差S生白芍组(A)3.23392.92373.50993.21580.3035酒白芍组(B)3.68194.47994.00774.0565∗0.4012

注：*表示与生白芍组相比有显著性差异。

3 讨论

阿魏酸具有抗血小板凝集和血栓，清除亚硝酸盐、氧自由基、过氧化亚硝基，抗菌消炎，抗肿瘤，抗突变，增加免疫的功能[9]。四物汤和阿魏酸均可使骨髓网织红细胞中微管内细胞质明显增多，有可能促进蛋白质合成，对骨髓造血功能起保护作用[10]。可见阿魏酸与四物汤的补血活血作用有较强的相关性，阿魏酸含量的变化可能会影响到四物汤的补血活血作用。

研究表明，川芎、当归酒制后阿魏酸含量均略有下降[11-13]，查阅文献发现结果并没有统计学差异，本实验的数据分析也没有发现川芎和当归酒制对复方中阿魏酸含量有明显影响；而文献报道川芎、当归配伍熟地对阿魏酸的溶出具有助溶作用[14]，本实验采用正交试验设计，各实验均配伍熟地一同煎煮，熟地对阿魏酸的助溶作用在各实验中具有均等的机会，因此本实验结果可以突出显示饮片酒制处理对整个复方中阿魏酸含量的影响。

白芍不同炮制品芍药苷含量大小为生白芍>炒白芍>醋白芍>酒白芍，说明白芍酒制后会降低芍药苷的含量[15]，但本研究在四物汤复方中未发现芍药苷含量降低的证据，反而通过正交试验和对比实验证实酒制白芍的确会升高四物汤复方中和白芍无关的阿魏酸的含量。对于芍药苷来说也可能存在另一种可能，白芍酒制后会降低芍药苷含量，但在四物汤复方中其他饮片可能有利于提升芍药苷含量，一降一升，在复方中没有发现芍药苷含量的变化。可见中药饮片的炮制除了会引起自身化学成分的变化，还可能会影响到复方中其他化学成分的变化，这是值得重视的一个中药炮制研究思路。

4 结论

实验表明，酒制白芍、酒制川芎和酒制当归对复方中5-羟甲基糠醛和芍药苷的含量影响不大，而酒制白芍配伍的四物汤与生白芍配伍的四物汤中阿魏酸含量有显著性差异，提示酒制白芍有利于提高四物汤复方中阿魏酸的含量。