菠菜子水提取物的抗炎活性及急性毒性实验研究

刘鸿雁，李 波*，郝宝成，姜专基，刘 渊，梁 云

(1.兰州市肺科医院，甘肃 兰州 730000；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050)

菠菜来源于藜科菠菜属植物菠菜SpinaciaoleraceaL.，又称菠薐，既作蔬菜用，又可入药，其入药始载于《食疗本草》，属药食同源类植物，具有利五脏、通肠胃热、解酒毒功效[1-2]。菠菜子是菠菜的果实，又称菠薐菜子，具有清肝明目、止咳平喘之效，主治风火目赤肿痛、咳喘[3-4]。药理研究表明菠菜提取物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗高血脂和降糖等活性[4-5]。菠菜在我国作为蔬菜有着悠久的栽培和食用历史，在长期的食用过程中发现菠菜和菠菜子具有药用属性，菠菜和菠菜子作为蔬菜国内外已有大量研究，作为药用，古代本草学对其功效和使用方法等亦有大量记载，但对其现代药学的系统性研究较少，尤其是菠菜子属于民间习用药材，其药理作用虽有一定研究基础，但不够系统和深入，导致其药用资源开发和临床应用受限。目前，随着对菠菜子药食同源开发利用的增多，应对其作用机理及药效进行研究，为菠菜子的临床合理应用和药材资源开发提供实验依据[6]。

中药作为我国传统医学的重要组成部分，有着悠久的应用和发展史。中药材来源受地域和古代认识水平所限，同一药材的基原、产地加工和药用部位往往在不同时期有不同的变化。目前，随着科技的发展和对中药研究的深入，中药的毒性越来越受到重视，近年来很多临床实践和研究发现，由于对中药材基原、炮制加工等认识欠缺，造成临床使用不当，导致中药在临床应用中不良反应事件频发，对中药的安全用药和临床使用造成很大影响。菠菜和菠菜子来源于同一植物的不同药用部位[6]，菠菜子属于古代传统和民间习用药材，故对其进行初步安全性研究，以期为菠菜子的安全性和临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料

SPF级昆明小鼠：体重(20±2)g，雌雄各半，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所实验动物中心提供(动物许可证号：SCXK(甘)2015-0001)。SPF级SD大鼠：体重(120±2)g，雄性，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所实验动物中心提供(动物许可证号：SCXK(甘)2015-0001)。饲养环境：SPF级别。饲养方法：按组分笼饲养，小鼠每笼6只，自由进食进水；小鼠每笼5只，自由进食进水。

1.2 药品和器材

电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，批号：20180411，精确度0.000 1 g)；一次性使用无菌注射器(2 mL，镇江康利医疗器械有限公司生产许可证：苏食药监械生产许20010222号)；二甲苯(天津市百世化工有限公司，批号：50180715)；水合氯醛(郑州市德众化学试剂厂，批号：20190315)；二甲苯(郑州市德众化学试剂厂，批号：20190315)；阿司匹林肠溶片(石药集团欧意药业有限公司，批号：286190163)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：170794)；菠菜子水提取物(兰州市肺科医院提供)；打孔器；棉球。

2 试验方法

2.1 对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响

取SPF级昆明小鼠60只，随机分为溶媒对照组、阿司匹林组0.30 g/kg、菠菜子水提取物0.75、1.50、3.00 g/kg剂量组，每组12只，雌雄各半，各组均以20 mL/kg灌胃给药，溶媒对照组给与等体积超纯水，1次/d，连续6 d。末次给药后45 min，各组小鼠于右耳两面均匀涂抹二甲苯0.05 mL，左耳不涂为对照。致炎后1 h颈椎脱臼处死小鼠，用直径6 mm的打孔器将双耳同部位等面积切下，取耳片于分析天平称重，按下式计算耳肿胀度及抑制率：

肿胀度(mg)=右耳片质量-左耳片质量

抑制率=(溶媒组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/溶媒组平均肿胀度×100%

2.2 对大鼠棉球肉芽肿的影响

取SPF级SD大鼠50只，雄性，随机分为溶媒对照组、醋酸地塞米松0.15 mg/kg和菠菜子水提取物0.5、1.0和2.0 g/kg剂量组，每组10只。用3.5%的水合氯醛麻醉，颈部剃毛，将2个高温灭菌的棉球约75 mg植入大鼠双侧腋窝皮下，手术线缝合皮肤，注射氨苄青霉素1 mg/0.1 mL抗感染。各组大鼠于手术后第2天以10 mL/kg体重给药剂量灌胃给药，1次/d，连续9 d。末次给药后1 h，颈椎脱臼处死小鼠，取出棉球，将棉球放入60 ℃烘箱中干燥12 h，称重，减去原棉球质量即为肉芽净重。

由于所形成的肉芽组织易向棉球纤维内浸润，在剥离肉芽肿组织时应小心，否则影响其准确性。由于棉球的表面积对实验结果的影响较大，为了减少差异，植入每只大鼠的棉球形状和植入部位应相似。

2.3 菠菜子水提取物急性毒性试验

2.3.1 预实验 取昆明小鼠40只，随机分为溶媒对照组和菠菜子水提取物(最大耐受量组以4的倍数共计设置4组：20 000 mg/kg、5 000 mg/kg、1 250 mg/kg、312.5 mg/kg)，每组8只，雌雄各半，连续观察7 d，详细记录动物毒性反应情况和死亡情况，计算半数致死量(LD50)的置信区间。

2.3.2 最大耐受量试验 取昆明小鼠40只，随机分为溶媒对照组和菠菜子水提取物最大耐受量(20 000 mg/kg，浓度1 g/mL)，每组20只，雌雄各半。各组均以0.4 mL/20 g灌胃给药，给药后2 h、4 h连续观察小鼠有无毒性反应及死亡情况，连续观察7 d，主要观察小鼠饮食、外观、行为活动、分泌物、排泄物等是否有异常，死亡情况，中毒反应症状及起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆及恢复时间等。分别于0 d、7 d称重。实验结束后，颈椎脱臼处死存活小鼠，解剖肉眼观察心肝脾肺肾、肾上腺、胸腺、卵巢、子宫、精囊、前列腺、睾丸、胃肠等脏器有无异常及明显病变。

3 结果与分析

3.1 统计学分析

用SPSS21.0统计软件进行处理，数据用(均数±标准差)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时用LSD检验，两两比较方差不齐时用Tamhane检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3.2 对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响

本实验结果显示，菠菜子水提取物能抑制二甲苯致小鼠耳肿胀，抑制率分别为低剂量组25.62%，中剂量组7.17%，高剂量组48.10%。菠菜子水提取物低剂量组和中剂量组与溶媒对照组相比较无统计学意义，且各剂量组未表现出剂量依赖性，其中，菠菜子水提取物高剂量组与溶媒对照组相比较有统计学意义(P<0.05)，提示菠菜子水提取物高剂量组具有抗炎、消肿作用，其抗炎机制需进一步研究。与阿司匹林阳性组比较，菠菜子水提取物各剂量组均无统计学意义(P>0.05)，提示菠菜子水提取物各剂量组的抗炎消肿作用与阳性药阿司匹林组相当，见表1。

组别n剂量(g/kg)肿胀度(mg)抑制率(%)溶媒对照组12-7.6750±2.83681-阿司匹林阳性组120.306.1417±2.5393119.90菠菜子低剂量组120.755.7083±3.5287025.62菠菜子中剂量组121.507.1250±2.412897.17菠菜子高剂量组123.003.9833±2.07050∗48.10

注：与溶媒对照组比较，*P<0.05。

3.3 对大鼠棉球肉芽肿的影响

直观分析发现：各剂量组对大鼠棉球肉芽肿的影响为高剂量组>中剂量组>低剂量组，但各剂量组比较无统计学意义(P>0.05)。菠菜子水提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组与溶媒对照组比较无统计学意义(P>0.05)，且各剂量组未表现出剂量依赖性。与醋酸地塞米松阳性组比较，菠菜子水提取物各剂量组的抑制作用相当(P>0.05)，见表2。

组别n剂量(mg/kg)肉芽比率(%)溶媒对照组10-2.9258±2.1674醋酸地塞米松阳性组100.152.5012±1.600菠菜子水提取物低剂量组105003.5010±1.1282菠菜子水提取物中剂量组1010002.5401±1.7836菠菜子水提取物高剂量组1020002.3489±0.8656

注：与溶媒对照组比较，*P<0.05。

3.4 菠菜子水提取物急性毒性预试验

实验期内各剂量组小鼠无死亡发生，小鼠精神状态良好，未观察到明显中毒现象，解剖肉眼观察心肝脾肺肾、肾上腺、胸腺、卵巢、子宫、精囊、前列腺、睾丸、胃肠等脏器未见明显病变及异常。

通过对各组小鼠的体重变化情况进行分析，结果表明各组小鼠的体重增长与溶媒对照组相比无显著性差异(P>0.05)，小鼠的体重变化情况见表3。

组别性别体重0d7d溶媒对照组♂20.73±0.8122.56±2.27♀21.49±0.4634.24±3.29312.5mg/kg组♂20.42±1.2923.92±1.27♀20.96±1.3933.27±1.621250mg/kg组♂21.09±0.2522.30±0.19♀21.33±0.7333.43±1.895000mg/kg组♂21.05±0.9624.11±2.24♀19.67±1.3432.75±2.7920000mg/kg组♂20.01±0.7222.64±0.73♀21.19±0.5634.04±2.16

3.5 最大耐受量试验

实验结果显示：实验期内各剂量组小鼠无死亡发生，小鼠精神状态良好，未观察到明显中毒现象，解剖肉眼观察心肝脾肺肾、肾上腺、胸腺、卵巢、子宫、精囊、前列腺、睾丸、胃肠等脏器未见明显病变及异常。

通过对两组小鼠的体重变化情况进行分析，结果表明最大耐受组小鼠的体重增长与溶媒对照组相比无显著性差异(P>0.05)，小鼠的体重变化情况见表4。

组别性别体重0d7d溶媒对照组♂21.18±0.9728.66±5.49♀21.45±0.3932.15±2.87最大耐受组♂21.02±0.6129.73±6.55♀21.41±0.5728.84±1.91

4 讨论

本试验依据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》[7]《中药制剂的急性毒性试验》[8]对菠菜子水提取物小鼠急性毒性进行了实验研究，并对菠菜子水提物的安全性进行了初步评价。结果显示：给药组小鼠在各自剂量下均未出现明显的中毒症状，也无死亡发生，尸检未发现各脏器异常。给药组小鼠的体重增长与溶媒对照组相比无显著性差异。小鼠在20 000 mg/kg体重的剂量下没有产生毒性作用，根据中药毒性的分级标准可确定为实际无毒。本试验未能测出该制剂的LD50，实验结果显示小鼠对菠菜子水提取物的最大耐受量(Maximal tolerance dose，MTD)为20 000 mg/kg体重，且没有产生毒性作用，根据中药毒性的分级标准可认为菠菜子安全性较好，但由于本研究采用的是水提物，对于菠菜子中其他有效化学成分或有效部位的安全性还需做进一步系统研究。

炎症是机体受到外伤、感染等损伤因子的刺激产生的一种以防御为主，损伤与抗损伤并存的基本病理过程。炎症通常会改变机体的正常生理指标，诱发多种急、慢性炎症疾病，并使含血管系统的生物机体产生复制的防御反应，炎症是一种病理过程，早期(急性炎症)主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进、渗出和水肿，中期表现为血小板吸附及白细胞游走，晚期为肉芽组织增生。二甲苯所致小鼠耳廓肿胀是研究急性炎症常用的模型，而大鼠棉球肉芽肿实验是研究慢性炎症常用的模型。本实验从不同炎症发展的不同阶段选取了两种模型进行研究。

本研究发现，两种抗炎模型中随着药物浓度增加，药效未相应增加，说明药物效应达到饱和的程度后，再继续增加药物浓度，其效应不会再增加，即菠菜子水提取物可能是一种时间依赖性的物质，决定疗效的重要因素取决于时间。综上，菠菜子水提取物具有良好的抗炎活性且安全无毒，在防治急慢性炎症、腹腔感染性疾病等方面具有很大的开发价值。目前，菠菜子的应用受限，今后应系统研究其安全性和有效性，需从多途径多通路入手，包括HPAA系统、花生四烯酸代谢系统、炎症因子、抗血栓、氧自由基清除等方面，在分子水平上探讨其抗炎作用机制，为菠菜子的临床合理应用及资源开发提供依据。