HPLC-MS/MS法测定猪肉和鸡肉中12种磺胺残留

李湘利，刘静，刘婉，王秋敏

1. 济宁学院生命科学与工程系，济宁市特色农产品高值化加工工程技术研究中心（曲阜 273155）；2. 山东嘉源检测技术有限公司，济宁市食品安全云检测工程技术研究中心（济宁 272100）

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是具有对氨基苯磺酰胺结构的药物总称，多有显著的抗菌活性[1]，是治疗尿路感染、耳部感染、支气管炎、皮肤和软组织感染的重要抗生素，被广泛应用于畜禽养殖领域[2]。通过任何途径摄入的磺胺类药物都会在人体中蓄积，导致机体过敏、造血紊乱、泌尿系统损害等[3]。磺胺类药物常用分析方法有高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱（GC）法、高效毛细管电泳（HPCE）法、酶联免疫分析（ELISA）法、生物传感器免疫分析（BIA）法、高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）法、气相色谱质谱（GC/MS）法、超临界流体色谱（SFC）法和微生物法等[4]。其中，HPLC-MS/MS法具有灵敏度高、选择性强等优势，用于复杂样品分析检测，可省去分离纯化代谢物样品的繁琐步骤[5]；根据药物原型成分的质谱裂解规律，可迅速推测并确定待测成分的结构信息，分析鉴定痕量成分[6]。

猪肉和鸡肉是最为常见的动物性食品原料之一，其磺胺类药物残留易在人体内蓄积[7]。为此，试验以猪肉、鸡肉为材料，参照GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱串-联质谱法》中磺胺兽药残留量的测定方法[8]，测定猪肉和鸡肉中12种磺胺类药物残留量，旨在建立一种操作简便、灵敏度高，适于猪肉、鸡肉中磺胺类药物残留的测定方法，明确磺胺类药物残留差别，为开展磺胺类药物残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、鸡肉，山东嘉源检测技术有限公司样品室提供。

乙腈（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；异丙醇、正乙烷（高效液相色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；磺胺醋酰（Sulphacetamide，SAA）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺吡啶（Sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SMR）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole，SMT）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SDM）、磺胺甲氧哒嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）、磺胺-6-甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺对甲氧嘧啶（Sulfamethoxydiazine，SMD）、磺胺氯哒嗪（Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲基异噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ），纯度≥99%，北京坛墨质检科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1260-6460-C液相质谱仪，安捷伦（中国）有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机，长沙湘仪仪器有限公司；均质器，德国IKA/艾尔；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；XH-C旋涡混合器，常州赛普实验仪器厂；XY200-2C电子天平，常州幸运电子有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取适量标准品，用甲醇配制成0.1 mg/mL的标准储备液。用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准工作液，质量浓度分别为10，20，40，60，80，100和200 ng/mL，储备液和工作液均于4 ℃保存。

1.3.2 样品前处理[8]

25个猪肉样品编号为Z-1～Z-25；25个鸡肉样品编号为J-1～J-25，样品于-18 ℃冷冻保存。将猪肉和鸡肉样品搅碎，准确称取5.00 g，置于50 mL离心管中，加入20 g无水硫酸钠和20 mL乙腈，均质2 min，再以3 000 r/min离心3 min。上清液转入100 mL圆底烧瓶中，残渣再加入20 mL乙腈，均质2 min，再以3 000 r/min离心3 min，合并上清液，向圆底烧瓶中加入10 mL异丙醇；用旋转蒸发器于50 ℃水浴蒸干，准确加入1 mL正乙烷和1 mL流动相（乙腈+0.01 mol/L的乙酸铵溶液，12+88）溶解烧瓶中的残渣。转移至5 mL离心管中，旋涡混合1 min，以3 000 r/min离心3 min，弃上层正乙烷，再加入1 mL正乙烷，重复上述步骤，直至下层水相为透明液体。另称取7份5.00 g空白猪肉样品，分别添加1 mL 10，20，40，60，80，100和200 ng/mL磺胺类药物混合标准溶液，按样品前处理方法制备空白提取液，下层清液过0.2 μm滤膜，即得上机待测液。

1.3.3 色谱和质谱条件[9]

液相色谱条件：Lichrospher 100RP-18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；进样量40 μL；流动相为乙腈和0.01 mol/L乙酸铵溶液；流速0.8 mL/min；分流比1∶3。

质谱条件：电子源为电喷雾离子源；离子源温度350 ℃；电喷雾电压5 500 V；雾化气压0.076 MPa；气帘气压力0.069 MPa；辅助气流6 L/min；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测（MRM）模式。12种磺胺类药物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压等参数见表1。

表1 12种磺胺类药物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压

1.3.4 HPLC-MS/MS法测定

用混合标准工作液分别进样，以工作溶液浓度（10，20，40，60，80，100和200 ng/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。

2 结果与分析

2.1 标准样品及样品添加色谱图

在设定的条件下对标准样品进行分析，12种磺胺类药物标准样品（100 ng/mL）的MRM色谱图见图1。由图1可知，12种磺胺类药物分离效果较好，无明显色谱杂质峰干扰。

2.2 标准工作曲线和线性范围

测定12种磺胺类药物标准工作溶液（质量浓度均为10，20，40，60，80，100和200 ng/mL），以峰面积（Y）和对应的质量浓度（X，ng/mL）作图，结果见表2。在10～200 ng/mL范围内，各磺胺类药物的质量浓度与对应的峰面积呈良好线性关系，相关系数r在0.997 3～0.999 7之间，均在0.997 3以上。

图1 12种磺胺类药物标准溶液MRM色谱图

表2 12种磺胺类药物标准工作曲线的线性方程及相关系数

2.3 方法检出限

对空白样品进行加标试验，以3倍信噪比对应的浓度为方法检出限（LOD），以10倍信噪比对应的浓度作为方法定量限（LOQ）[10]。猪肉、鸡肉空白基质添加混合标准使用液，在多次重复验证试验基础上将12种磺胺类药物的方法检出限定为2 μg/kg，将定量限定为10 μg/kg，远低于欧、美、日等国家设定的残留最大限量[11]，说明HPLC-MS/MS法可提高定量分析的选择性和灵敏度，检出限较低，满足分析要求。

2.4 保留时间

12种磺胺类药物不同浓度标准物质的定量结果见表3。由空白猪肉样品10，20，40，60，80，100和200 ng/mL（L1～L7）的保留时间可知，各水平下磺胺类药物保留时间相差不超过0.02 min，出峰时间稳定，表明色谱操作条件稳定，可作为定性分析依据。12种磺胺类药物从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值的时间分别为磺胺醋酰2.49 min、磺胺嘧啶3.05 min、磺胺噻唑3.44 min、磺胺吡啶3.63 min、磺胺甲基嘧啶3.85 min、磺胺甲噻二唑4.44 min、磺胺二甲嘧啶4.50 min、磺胺甲氧哒嗪4.58 min、磺胺-6-甲氧嘧啶4.58 min、磺胺对甲氧嘧啶4.59 min、磺胺氯哒嗪5.21 min、磺胺甲基异噁唑5.57 min。

表3 12种磺胺类药物在不同添加水平下的保留时间

2.5 方法的回收率

猪肉和鸡肉的空白基质分别加入2，8和20 μg/kg的低、中、高3个浓度的标准溶液，按样品前处理方法进行前处理以评价加标回收率，结果见表4和表5。结果表明，猪肉样品空白基质中12种磺胺化合物3个加标水平的平均回收率为94.2%～133.4%，相对标准偏差（RSD）为2.07%～6.11%；鸡肉样品空白基质的平均回收率为89.1%～112.2%，RSD为2.46%～5.87%。这说明使用基质匹配的标准工作曲线进行校正，可消除基质效应影响，对猪肉和鸡肉中12种磺胺类药物残留的测定有良好的准确度，符合残留分析要求。

表4 猪肉样品的添加回收率

表5 鸡肉样品的添加回收率

2.6 实际样品的测定

选取25个猪肉样品和25个鸡肉样品测定12种磺胺类药物的残留量，结果见表6。各样品的磺胺类药物的残留量相对较低，残留量低于农业部235号公告规定的动物组织磺胺类药物残留限量100 μg/kg[12]；25份猪肉样品中有3份样品被检出磺胺类药物残留，其余样品未检出，猪肉样品中被检测出的4种磺胺类药物分别为磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶；25份鸡肉样品中有1份样品被检出磺胺嘧啶药物残留，其余未测出；所有猪肉和肌肉样品的磺胺类药物残留均未超标，残留量均合格。

表6 样品中磺胺类药物残留检测结果

3 结论

采用GB/T 20759—2006液相色谱-串联质谱法检测猪肉和鸡肉中12种磺胺类药物残留，该法在10～200 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r高于0.997 3，方法检出限为2 μg/kg，定量限为10 μg/kg；猪肉和鸡肉样品空白基质中12种磺胺药物3个加标水平（2，8和20 μg/kg）的平均回收率分别为94.2%～133.4%和89.1%～112.2%，RSD分别为2.07%～6.11%和2.46%～5.87%。猪肉中的磺胺类药物残留被检测出的样品份数高于鸡肉的检出份数，被检测的12种磺胺类药物，磺胺嘧啶残留被检出，其次是磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶。猪肉样品中的磺胺类药物检出率为12%，鸡肉样品中的磺胺类药物检出率为4%。所检试样的磺胺类药物残留量均未超标，符合国家限量标准（农业部235号公告）规定。GB/T 20759—2006中的方法可对猪肉和鸡肉中的磺胺类药物残留进行定性和定量分析，具有回收率与准确度高、选择性好、操作简便等优点，可满足检测和监管需求。