GC-MS/MS法测定水果、蔬菜中敌草快的残留量

陈卢涛，朱萌萌，刘小羽，黎斌，俞璐萍，杜启伟

1. 绿城农科检测技术有限公司（杭州 310000）；2. 浙江工业大学（杭州 310000）

敌草快（Diquat dibromide），是在1955年由英国ICI公司开发的一种联吡啶类除草剂，对阔叶杂草有很强的防除能力，被广泛应用于水生杂草的防除[1]。敌草快作为一种水溶性非常大的农药，由于其良好的除草催枯作用，近年来从旱地作物转向水稻等作物上大规模使用[2]。杨亚哲等[3]研究表明，敌草快通过干扰植物细胞膜，破坏光合作用，对藻类和溞类具有急性毒性；鲍伟光等[4]研究表明，敌草快可对育肥猪肠道造成严重损伤并减弱肠道的消化功能。

国内外对敌草快农药的检测分析方法主要包括气相色谱（GC-FID）法[5-6]、气相色谱-质谱[7-9]（GCMS）法、液相色谱（HPLC）法[10]、液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法[11-12]、毛细管电泳色谱法[13]、表面增强拉曼散射（SERS）法[14-15]。由于敌草快以季铵盐类形式存在，具有很强的极性，难挥发，因而很少直接用气相色谱或气相色谱-质谱法测定，需要先进行衍生化将其转化为挥发性化合物。试验拟采用5%的氯化镍溶液作为催化剂，比较硼氢化钠和硼氢化钾用于敌草快衍生化反应的优劣，并结合GC-MS/MS方法，探究一种操作简便、试验成本低、分析速度快、结果准确可靠的方法，用于水果、蔬菜中敌草快残留量的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

敌草快标准品（纯度≥99.0%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）；硼氢化钠、硼氢化钾（含量≥97.0%，上海凌峰化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（含量≥99.0%，上海凌峰化学试剂有限公司）；六水合氯化镍（5%水溶液，取5 g溶解到100.0 mL去离子水，上海凌峰化学试剂有限公司）；中性氧化铝（100～200目，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸、氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯，美国J.T. Baker公司）；试验所用水均为去离子水；微孔有机滤膜（0.22 μm）。

1.2 仪器与设备

GC-2010 plus气相色谱仪配TQ 8040质谱仪，VF-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，日本Shimadzu公司）；BSA2202S电子天平（德国Sartorius公司）；漩涡混合器（美国Henry Troemner公司）；KQ5200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ST-16R离心机（美国Thermo Fisher公司）；CHK-121台式精密酸度计（北京昌科仪自动化科技有限公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件

进样口温度，250 ℃；载气，高纯氦气；碰撞气，高纯氩气，纯度≥99.999%；柱流量1.0 mL/min；进样方式，不分流进样，1.0 min后开阀；进样量，1 μL；定量方法，外标法。升温程序：80 ℃保持0 min，以40 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。

1.3.2 质谱条件

色谱-质谱接口温度，280 ℃；电离方式，EI；电离能量，70 eV；离子源温度，230 ℃；检测器电压，0.98 kV（+0.4 kV）；测定方式，MRM多重反应监测模式；定量、定性离子、碰撞能量等参数见表1。

表1 敌草快质谱检测参数

1.4 试验步骤

1.4.1 提取

称取2.00 g（精确至0.01 g）蔬菜或水果样品于15 mL离心管中，加入4.0 mL纯净水浸泡0.5 h，涡旋器振荡3.0 min，超声提取30 min，待衍生。

1.4.2 衍生化

向上述提取液中加入0.5 mL催化剂5%的氯化镍溶液，盖上瓶盖，涡旋0.5 min，加入20 mg硼氢化钠，过程中会产生大量气泡，应小心操作，防溢出。再次盖上瓶盖，涡旋0.5 min，放入85 ℃烘箱内反应25 min，冷却至室温后待净化。

1.4.3 净化

向上述衍生液中加入0.5 g中性氧化铝，涡旋3 min，准确加入1.0 mL正己烷后再次涡旋3 min，以8 000 r/min下离心3.0 min，取上清液，加入0.1 g无水硫酸钠后过膜，供气相色谱-串联质谱检测。

1.4.4 标准溶液的配制

称取0.010 0 g敌草快，用去离子水定容至25.0 mL，分别得到约400 mg/L标准储备溶液；用去离子水稀释为50.0 mg/L标准工作溶液，于0～4 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 气相色谱-质谱条件的优化

在电子轰击离子源（EI）检测模式下对敌草快进行一级质谱分析（Q3 Scan）。在质谱图中选择质荷比较大，绝对强度较大的离子为前体离子；设定3～45 eV（每3 eV一个间隔）的碰撞能量，对选定的前体离子峰进行二级质谱分析（产物离子扫描），根据二级质谱图，选择离子强度最大的为定量离子，离子强度次之的为定性离子。敌草快经硼氢化钠/氯化镍还原反应，转化为沸点较低的物质1, 1-乙基-2, 2-联哌啶。经观察，该物质存在顺反同分异构体，在串级质谱上会出现两个峰，且3个离子对比率相似，虽与GB/T 5009.221—2008《粮谷中敌草快残留量的测定》中出现单峰不同，但与高利娜等[9]采用固相微萃取结合气质联用法测定血浆中敌草快的结果一致，图1为使用优化后的气相色谱质谱条件采集敌草快（100 μg/L）标准溶液MRM质谱图。

图1 敌草快MRM色谱图

2.2 衍生化试剂的选择

敌草快具有较高的沸点（＞300 ℃）和一定的极性，通常需要衍生化反应后再进行气相色谱质谱分析，试验比较硼氢化钠和硼氢化钾2种衍生化试剂对敌草快衍生化反应的效率和适宜性。

在15 mL离心管中加入20.0 μL 50.0 mg/L敌草快标准储备液，分别添加5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0和60.0 mg 2种衍生化试剂，在常温条件下，按照1.4.2的衍生化方法进行衍生30 min，并将最终体积定容为1.0 mL上机分析。结果表明（见图2），随着硼氢化钠添加量增加，敌草快衍生化产物响应逐渐提高，添加量增加到10.0 mg时，衍生化产物含量呈稳定趋势。随着硼氢化钾添加量增加，敌草快衍生化产物响应逐渐提高，添加量增加到10.0 mg时，衍生化产物含量呈稳定趋势。为保证衍生化反应完全，选择硼氢化钠和硼氢化钾的添加量20.0 mg，且此时两者衍生化合物含量也趋于一致。综合考虑试验成本及衍生化产物的响应，选择硼氢化钠添加量20.0 mg。

图2 2种衍生化试剂添加量对衍生化效率的影响比较

2.3 衍生化条件的优化

2.3.1 衍生温度的选择

敌草快在不同衍生温度下衍生效率差别较大，试验以硼氢化钠为衍生化试剂，衍生时间30 min，正己烷为提取溶剂，比较不同衍生温度的衍生效率。称取1.0 g苹果样品，添加20.0 μL 50.0 mg/L敌草快标准工作液和4.0 mL去离子水，通过衍生和提取，比较不同温度条件下的衍生效率。结果表明（见图3），敌草快受不同衍生温度影响较大，随着温度增大，衍生效率逐渐提高。温度增加到80 ℃时，衍生化产物含量呈稳定趋势。综合考虑，选择80 ℃为最佳衍生温度。

图3 温度对衍生效果的影响

2.3.2 衍生时间的选择

敌草快在不同衍生时间下衍生效率差别较大，试验以硼氢化钠为衍生化试剂，衍生温度80 ℃，正己烷为提取溶剂，比较不同衍生时间的衍生效率。称取1.0 g苹果样品，添加20.0 μL 50.0 mg/L的敌草快标准工作液和4.0 mL去离子水，通过衍生和提取，比较不同衍生时间下的衍生效率。结果表明（见图4），敌草快受不同衍生时间影响较大，随着时间延长，衍生效率逐渐提高。时间增加到25 min时，衍生化产物含量呈稳定趋势。综合考虑，选择最佳衍生时间25 min。

图4 时间对衍生效果的影响

2.3.3 净化试剂的选择

敌草快在衍生化后产生大量黑色物质，对仪器分析产生较大干扰。试验以硼氢化钠为衍生化试剂，衍生温度80 ℃，衍生时间25 min，正己烷为提取溶剂，考察中性氧化铝的净化效果。称取1.0 g苹果样品，添加4.0 mL去离子水，衍生后加入0.5 g中性氧化铝，涡旋3 min后加入1 mL正己烷提取，比较净化前后的总离子流图情况。结果表明（见图5），中性氧化铝有较好的净化效果。

图5 净化前后总离子流图

2.4 基质效应的考察

基质效应（ME）指样品中除分析物以外的其它成分对待测物测定值的影响，即基质对分析方法准确测定分析物能力的干扰。试验前处理衍生过程产生大量黑色物质，可能对目标物的响应产生一定的影响，按照Stahnke中的添加法定量评价基质效应强度，分别测定空白提取液与纯溶剂中添加相同浓度分析物的离子响应强度，考察在添加1.00 mg/kg条件下，不同基质条件对敌草快响应的影响，结果见图6。

式中：Pm为基质加标峰面积；Ps为纯溶剂标准溶液峰面积。

敌草快在萝卜样品中存在明显的基质抑制效应，在其他基质中均存在基质增强效应，这与已知的气相色谱分析中大多数农药表现出不同程度的基质增强效应论点相吻合。敌草快在苹果和辣椒中的基质增强效应均比其它基质要强，可能与苹果基质中含有较多的糖分、辣椒基质中含有较多的辣椒素有关，在前处理过程中未得到有效净化。在基质效应存在情况下，试验选取基质匹配标准曲线定量，可以一定程度上降低基质效应的影响，使定量结果更加准确。

2.5 方法的线性范围、加标回收率、精密度和定量限

取0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/L 5个质量浓度的敌草快，按优化色谱条件进样1 μL，以峰面积为纵坐标，标准样品的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，其线性回归方程及相关系数见表2，以信噪比S/N≥3估算仪器的检出限（LOD），S/N≥10估算仪器的定量限（LOQ），结果见表2。

称取市售的柚子、青菜、火龙果、百香果、柑橘、土豆、苹果、花菜、辣椒、萝卜10个样品，分别添加20，50和100 μg/kg不同水平的敌草快标准溶液进行回收率试验，每个添加水平重复3次，加标回收结果见表3。敌草快的平均回收率为73.9%～92.8%，相对标准偏差小于9.4%，符合GB/T 27404—2008附录F中对检测方法确认的要求。

图6 不同基质对敌草快的基质效应影响（n=3）

接表3

3 结论

试验比较硼氢化钠、硼氢化钾2种衍生化试剂用于敌草快衍生化反应的优劣，2种衍生化试剂均可用于敌草快的衍生化反应检测，敌草快经硼氢化钠或硼氢化钾衍生后，会产生同分异构体2个峰，采用峰面积加和的方式参与计算，定量更准确。对敌草快在不同基质中的基质效应进行探讨，采用基质匹配标准曲线定量可以有效降低基质效应。采用优化后的GCMS/MS方法，在空白样品添加浓度0.02，0.05和0.10 mg/kg不同水平的敌草快标准溶液，敌草快的平均回收率为71.3%～95.3%，相对标准偏差小于6.4%，符合GB/T 27404—2008附录F中对检测方法确认的要求。因此优化后的方法操作简便，分析速度快，抗干扰能力强，适用于水果、蔬菜中敌草快的定性、定量检测。