UPLC-Q/Orbitrap MS法检测水产品中12种抗生素残留

李涛，谭璐*，徐文泱，杨滔，王芳斌

1. 湖南省食品质量监督检验研究院，食品安全监测与预警湖南省重点实验室（长沙 410111）；2. 长沙商贸旅游职业技术学院（长沙 410004）

水产品具有味道鲜美、营养丰富、易消化吸收等优点，是一种优质动物蛋白食物来源，深受人们喜爱。渔业环境污染和药物的滥用严重影响水产品的质量和食品安全。大环内酯类抗生素是以大环内酯为母核，与分子糖通过糖苷键连接的一类抗生素[1]，对革兰氏阳性菌及支原体有较强的抗菌活性[2-3]。四环素类抗生素是由放线菌产生的一类光谱抗生素，具有共同多环并四苯羧基酰胺的衍生物，能够抑制细菌蛋白质的合成，被广泛应用于细菌感染疾病的治疗[4-5]。大环内酯类和四环素类抗生素在畜禽养殖和水产养殖过程中广泛使用，在生态环境大量残留，会导致水产品中抗生素残留，通过食物链进入人体，严重影响人类健康[6-8]。为保障食品安全，农业部对水产品中大环内酯类和四环素类抗生素限量值进行了规定[9]。目前，大环内酯类和四环素类的检测方法主要有液相色谱法[10-11]、液相色谱质谱法[12-14]、微生物法[15]、电化学法[16-17]等。微生物法存在特异性差，难以准确定性定量等缺点；高效液相色谱对于兽残检出种类有较大局限性；液相色谱质谱法较为普遍。

四极杆/轨道阱高分辨质谱（Q Exactive Focus）是近年来发展起来的新式的质谱，具有高分辨率和高质量精度的特点，可以实现常规质量测定，能实现异构体或结构类似的物质的区别鉴定以及未知物的确证，现已在农药残留分析[18]、兽药残留分析[19]和保健食品非法添加[20]等领域应用。试验利用四极杆/轨道阱高分辨质谱联用系统，建立了水产品中7种大环内酯类和5种四环素抗生素化合物的快速筛查方法，使用精确质量数及其二级质谱定性，大幅提升定性准确性，降低基质干扰影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Q Exactive Focus液相色谱-质谱联用系统（美国Thermo Fisher Scientific）；Hypersil Gold 色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm，美国Thermo Fisher Scientific）。

生鲜草鱼（市售）。乙腈（色谱纯，上海安谱）；甲醇（色谱纯，上海安谱）；甲酸（色谱纯，上海国药）；乙酸铵（分析纯，上海国药）；泰乐菌素、替米考星、罗红霉素、克拉霉素、红霉素、林可霉素、米诺环素、美他环素、金霉素、强力霉素标准品（德国Dr公司）；交沙霉素、差向四环素（中国药品生物制品检定所）。

1.2 样品的制备

样品取可食用部分混匀，精密称取2.0 g混匀后样品，置于50 mL离心管中，加入25.0 mL 80%乙腈0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine溶液，振荡摇匀处理30 min，冷冻离心，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Hypersil Gold C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相A，0.1%甲酸水溶液；流动相B，乙腈；采用梯度洗脱模式进样，梯度洗脱程序详见表1；流速0.2 mL/min，柱温30 ℃，进样体积5 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.4 质谱条件

离子源HESI，毛细管电压3 000 V，扫描模式PRM/Targeted-MS2，扫描范围m/z100～950，分辨率（R）35 000；电喷雾离子源温度320 ℃，气化温度350 ℃，鞘气压（N2）40 arb，辅助气压（N2）15 arb，离子传输管温度320 ℃，喷雾电压4.0 kV。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

在相同流动相、梯度洗脱程序及相同色谱条件下，分别选择Hypersil Gold C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）、Hypersil Gold C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）和Hypersil Gold C8色谱柱色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）对12种抗生素化合物进行色谱分离。结果显示，3种色谱柱对大环内酯类和四环素类抗生素能进行有效分离，其中Hypersil Gold C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）分离效果最优，因此采用Hypersil Gold C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）。

2.1.2 流动相的选择

在相同的洗脱程序和相同色谱柱下，无机流动相分别选择水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙酸铵（5 mmol/L），有机流动相选择乙腈考察分离效果。结果显示，水溶液-乙腈分离峰形较差，0.1%甲酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸乙酸铵（5 mmol/L）-乙腈流动相均对12种抗生素分离效果良好，流动相中加入0.1%甲酸可显著提高目标物电离效果，提高质谱响应，乙酸铵未明显改善目标化合物的分离与质谱响应，为减少乙酸铵离子对于质谱的污染，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈流动相体系。通过优化试验，确定采用梯度洗脱程序。图1为12种抗生素标准溶液的提取定量色谱图，显示化合物之间得到有效分离。

图1 标准溶液中12种抗生素化合物定量离子色谱图

2.2 质谱条件的选择

依据目标物化学分子量，在四极杆质量分析器的分析窗口，进行质谱全扫描分析，得到目标物母离子信息，再分别设置低、中、高碰撞电压，检测碎片离子。取标准品溶液直接进质谱，得到目标化合物的母离子参数，在母离子参数基础上，设置碰撞电压，轨道阱自动检测子离子，12种抗生素质谱参数见表2。

表2 12种化合物的离子选择参数表

2.3 线性范围、检出限和定量限

分别精密称取空白草鱼，按样品制备方法制备基质提取液，以基质提取液为稀释液，配制基质标准溶液，浓度分别为2.0，5.0，10.0，15.0，20.0和50.0 ng/mL，以峰面积的响应值Y为纵坐标，标准溶液浓度X（ng/mL）为横坐标，外标法制作标准曲线。在空白草鱼样品添加低浓度混合标准溶液，按样品制备方式处理，进液质联用仪检测，以3倍和10倍信噪比计算检出限和定量限。12种抗生素的线性范围、检出限和定量限见表3。12种大环内酯药物在2.0～50 ng/mL浓度范围内线性关系良好，线性回归系数均在0.996以上，7种大环内酯类抗生素的检出限在0.073～2.4 μg/kg之间，低于SN/T 1777.2—2007的规定（检出限20 μg/kg），5种四环素类抗生素的检出限在1.9～17 μg/kg之间，低于GB/T 21317—2007的规定（检出限50 μg/kg）；定量限在0.24～50 μg/kg之间。

表3 12种化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 准确度和精密度

在空白草鱼样品中加入混合标准溶液，加标后样品浓度分别为10.0，20.0和100.0 μg/kg，每个浓度样品制备6份，测定12种抗生素的浓度，计算回收率和RSD值。由表4可知，当加标浓度为10.0 μg/kg时，回收率为83.1%～94.0%，精密度RSD为3.2%～5.6%；当加标浓度为20.0 μg/kg时，回收率为86.1%～95.7%，精密度RSD为1.6%～4.8%；当加标浓度为100.0 μg/kg时，回收率为88.2%～94.5%，精密度RSD为0.8%～3.8%。

表4 12种化合物的回收率和精密度

2.5 实际样品的检测

应用此次试验所建立的检验方法对市场采购的15个鲜活水产品进行检测，采用保留时间进行定性，结合离子丰度比和二级特征离子进行确证，均未检出阳性样品。

3 讨论与结论

UPLC-Q-Orbitrap质谱具有高分辨率和高质量精度的特点，可用于高通量筛查，同时也可含量测定。此次试验建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定水产品中12种抗生素，并进行了方法学验证。该方法简单高效、灵敏度高，为水产品中大环内酯类和四环素类抗生素检测提供方法参考，也对现有国家标准检测大环内酯类和四环素类抗生素具有有力补充。