马海峰,陶唐平,方林明,刘成林,单平平,陈辉德*
安徽中创食品检测有限公司(芜湖 241000)
黄曲霉毒素是一类由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的代谢产物,目前发现的有20余种,确定结构的有17种[1-2]。黄曲霉毒素极易污染粮油及其制品,如花生、花生油、玉米及大米等,在众多黄曲霉毒素中以黄曲霉毒素B1分布最为广泛,并且是毒性最强的一种,被确认为I类致癌物[3-7]。多数国家非常重视黄曲霉毒素B1防控,并制定食品中黄曲霉毒素B1的限量标准[8-11]。
食品中黄曲霉毒素B1常用的检测方法有薄层色谱(TLC)法、酶联免疫(ELISA)法、高效液相色谱(HPLC)法及液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)法[12-20]等。TLC是检测黄曲霉毒素B1的经典方法,但前处理繁琐,易受杂质干扰并且定量起来较为困难。ELISA法检测过程比较简便,但有可能产生假阳性或假阴性结果,检测准确度有待提高。HPLC-MS法检测结果准确,检出限低,但仪器价格昂贵,不易普及。因此通常采用HPLC法测定黄曲霉毒素B1。
HPLC法测定黄曲霉毒素B1过程中,为了排除提取液中的杂质对分离和检测干扰,需要采用免疫亲和柱[19-20]或专用固相萃取柱[21]净化,成本较高。试验基于液液萃取对提取液进行净化,并考察流动相组成和提取溶剂比例对结果的影响,验证不同基质的加标回收率和精密度;建立一种操作方便,灵敏度好,准确性高的黄曲霉毒素B1高效液相色谱检测方法。
液相色谱仪配荧光检测器(LC-20A,SHIMADZU);电子分析天平(ME-204,METTLER TOLEDO);超声波清洗机(KQ-800DE,昆山市超声仪器有限公司);涡旋混合器(Lab dancer,IKA);氮吹仪(N1,上海屹尧科技有限公司);均质器(T25,IKA);超纯水机(Milli-Q,Millipore);高速离心机(TDZ5-WS,湘仪离心机仪器有限公司);有机系滤头(0.22 μm,上海安谱实验科技股份有限公司)。
甲醇、乙腈、三氯甲烷、正己烷(色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);黄曲霉毒素B1标准储备溶液(3 μg/mL,美国o2si标准品公司);亚铁氰化钾、乙酸锌、碘(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);流动相用水(GB/T 6682规定的一级水)。
用初始流动相将黄曲霉毒素B1标准溶液逐级稀释,最终得到0.1,0.5,2.5,5.0,10.0,25.0和50.0 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准系列工作溶液。
Shim-pack GIST C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇-乙腈-水(15∶20∶65,体积比);流速1.0 mL/min;柱温40 ℃;进样量50 μL;柱后衍生系统(衍生溶液,0.05%碘溶液;衍生溶液流速0.2 mL/min;衍生反应管温度70 ℃);荧光检测器(激发波长360 nm,发射波长440 nm)。
1.4.1 提取
准确称取5 g左右试样于50 mL塑料离心管中,加入10.0 mL乙腈-水(85∶15,V/V)混合提取液,涡旋混匀1 min后,水浴超声30 min。冷却至室温后,加入2 mL亚铁氰化钾溶液(92 g/L)和2 mL乙酸锌溶液(183 g/L),混匀后静置10 min。于离心机中以5 000 r/min离心10 min,上清液转移至25 mL容量瓶中。于残渣中加入5.0 mL上述提取液,重复提取1次,合并2次提取液于同一25 mL容量瓶中,并定容至刻度。(液体样品直接加乙腈定容至25 mL)。
1.4.2 净化与浓缩
准确吸取5.0 mL上清液,加入5 mL正己烷,涡旋2 min后弃去上层溶液(如产生乳化现象,可于离心机中4 000 r/min离心5 min)。于上述溶液中加入5 mL三氯甲烷,充分涡旋3 min,以5 000 r/min离心10 min,将三氯甲烷层转移到另一离心管中。重复萃取1次,合并2次萃取液于60 ℃水浴中氮吹至干。用初始流动相复溶并定容至1.0 mL,过0.22 μm滤膜后以备测定。
1.4.3 测定
将净化后的样液注入液相色谱仪中,在与标准系列工作液相同的仪器条件下测定峰面积,根据外标法比较定量。
采用的净化方式是液液萃取,相比于免疫亲和柱或专用固相萃取柱来说,液液萃取净化法得到的净化液中可能会残留一些杂质,从而对检测造成干扰[22-23]。为满足实际检测需求,通过考察甲醇、乙腈与水之间不同比例组成,并结合检测效率最终确定以甲醇-乙腈-水(15∶20∶65,体积比)作为流动相,等度洗脱且流速设置为1.0 mL/min。图1为此流动相条件下的黄曲霉毒素B1标准系列工作液色谱图。
图1 黄曲霉毒素B1标准系列工作液色谱图
将1.2中的黄曲霉毒素B1标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪进行测定,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,见图2。在0.1~50 ng/mL质量浓度范围内,峰面积与浓度呈现良好线性关系,线性回归方程为y=74 178.3x-7 972.1,拟合系数为0.999 97。以3倍信噪比(S/N=3)计算仪器检出限,结合检测前处理过程计算黄曲霉毒素B1的方法检出限为0.02 μg/kg。
图2 黄曲霉毒素B1标准曲线
2.3.1 提取溶剂的选择
黄曲霉毒素B1易溶于甲醇、乙腈和三氯甲烷等溶剂,通常采用含有一定比例甲醇或乙腈水溶液提取样品中的黄曲霉毒素B1。以空白花生样品为基质(加标量20 μg/kg),选用乙腈-水作为提取溶剂,分别探究不同比例的乙腈-水(90∶10,85∶15,80∶20,75∶25,70∶30,60∶40和50∶50,体积比)对目标物提取率的影响,结果见图3。乙腈与水体积比85∶15时,提取率最高为85.6%。
图3 不同比例的乙腈-水提取液对花生样品中黄曲霉毒素B1的提取率比较
2.3.2 净化方式的选择
提取液中黄曲霉毒素B1常用的净化方法有免疫亲和柱法[19-20],专用固相萃取柱法[21]和液液分配法[22-23]等。前两者虽净化效果优越,但耗时长,价格高,有一定局限性。因此试验采用液液分配法进行净化,在提取液中加入亚铁氰化钾和乙酸锌除去蛋白质,加入正己烷进行涡旋,分离脂溶性杂质。在样液中添加三氯甲烷进行目标物的萃取,浓缩、定容,采用柱后碘衍生-高效液相色谱荧光检测器进行检测。从图4可以看出,色谱图背景干净,花生样品本底无目标峰,加标样中目标峰与杂峰分离明显,说明液液萃取有较好的净化作用。液液分配法可以净化的特点主要有:提取液中加入蛋白沉淀剂可以除去提取液中的蛋白质;黄曲霉毒素B1难溶于正己烷,利用这一特性可以加入正己烷除去脂溶性杂质;黄曲霉毒素B1易溶于三氯甲烷,加入三氯甲烷后利用分配系数的差异将目标物转移到三氯甲烷中,起到进一步净化作用。
图4 花生空白样品及加标样品色谱图
2.3.3 加标回收试验及精密度测定
取花生、玉米、黄豆、大豆油、酱油、腐乳、辣椒、婴幼儿米粉等不同基质的样品,分别加入低(0.4 μg/kg)、中(4.0 μg/kg)、高(40 μg/kg)浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液,并按上述方法检测,各基质样品中的黄曲霉毒素B1的加标回收率结果见表1。由表1可得,所选的样品本底中黄曲霉毒素B1都未检出;加标量0.4,4.0和40 μg/kg时,回收率范围分别为75.9%~89.6%,78.5%~90.4%和82.1%~94.7%;每个加标量的相对标准偏差(RSD,n=6)分别为1.1%~5.4%,0.5%~5.2%和0.1%~1.8%。由此可见,该方法检测的准确性和重复性良好,能满足分析测试要求。
表1 不同基质中加标回收率和精密度分析(n=6)
试验建立一种简单快速的测定食品中黄曲霉毒素B1方法,样品提取液经液液萃取净化、浓缩及定容后,用柱后碘衍生-高效液相色谱检测。利用该法对花生、玉米及黄豆等8种样品进行验证,结果证明方法无明显杂质干扰,并且准确性和重复性良好。此方法与传统高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1相比,操作方便,灵敏度好,准确性高,成本低廉,可推广用于食品中黄曲霉毒素B1检测。