核桃肽制备工艺的研究进展

郝云涛，珠娜，李勇*

北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系（北京 100191）

中国核桃资源丰富，产量居世界第一位，但主要应用于榨油及初级食品制作，产品附加值低，如何充分发挥核桃的营养价值和保健功能，是食品科技工作者和营养学家关注的焦点。近年来，随着肽营养学的建立与发展，以及相关制备技术的进步，对核桃的开发重点也由提取油脂转移到制备肽类物质，且开发制备的核桃肽类物质在抗氧化性、抗疲劳、调节血压、提高学习记忆等方面表现出显著功效[1-4]。从最初核桃制油到后来核桃蛋白的制备，至如今核桃肽的制备，所用制备方法和关键技术不同，可在充分掌握目标物质性质的基础上，选择合适的制备方法和技术，将其活性肽类成分进一步富集，制取足量的食源性药物，推动全人类健康事业发展。

1 核桃肽的定义及组成

核桃蛋白质含量丰富，约占16.66%，且氨基酸种类齐全，包含人体必需的8种必需氨基酸，此外，其氨基酸模式与人体蛋白质氨基酸模式近似，为制备核桃肽提供良好物质基础[5-6]。核桃肽是由核桃蛋白经水解而获得的具有生物活性功能的一类物质，根据分子量和所含氨基酸数目分为核桃多肽与核桃寡肽。核桃肽的分子量、氨基酸数目及排列并非固定，受核桃产地、品种及制备方法和技术的影响。邵静哲[7]通过黑曲霉3.350发酵核桃粕制取的核桃肽，分子量＜10 kDa的肽占70.47%，分子量＜5 kDa的肽占47.24%。陈树俊等[8]以高蛋白核桃粉为原料，选用复合蛋白酶对其进行水解制备核桃肽，分析发现分子量≤5 kDa的肽占64.94%，其他分子量分布依次为5～10 kDa（23.33%）≥30 kDa（6.41%）和10～30 kDa（5.32%）。

2 核桃肽的理化性质

与核桃蛋白相比，其水解产物核桃肽具有高浓度、低黏度、溶解性好、还原能力强及对pH变化相对稳定等良好特性，在起泡性、乳化性及吸油性等方面优于核桃蛋白[9-11]。核桃肽优良的理化特性进一步提升其加工特性，为核桃肽更广泛的应用奠定基础，开发丰富的核桃肽产品成为研究热点。

3 核桃肽的制备

核桃油脂含量高，一般将榨油后的核桃粕作为制备核桃肽的原料，这也是对核桃综合利用思想的体现。核桃肽的制备思路是对蛋白质进行不同程度分解，将其肽段释放，经过分离、纯化、富集等步骤，制备得到核桃肽。核桃肽的制备工艺流程为：

核桃→预处理→提取核桃蛋白→水解→核桃蛋白水解产物→分离纯化→核桃肽类物质

3.1 核桃原料预处理

核桃种皮为包裹在核桃仁表面的一层薄膜，呈黄色或浅黄色，在贮存过程中会出现氧化、褐变现象。此外，核桃种皮含有大量酚类物质，会产生令人不悦的收敛性口感，会使核桃蛋白凝集沉淀，还会影响核桃产品色泽，降低感官品质，因此需通过热水浸泡、碱液浸泡等方法将种皮去除，再进行下一步处理[12-13]。预处理的另一步骤是将去皮后的核桃仁榨油，对常用的核桃油提取方法优缺点及应用范围进行比较，如表1所示[14-17]。

表1 常见油脂提取方法比较

近年来，很多学者在核桃油脂提取过程采用特定辅助提取技术，提高提取效率，提升油脂品质。作为一种新型提取分离技术，超临界流体萃取技术解决溶剂提取法在分离过程中需蒸馏加热、溶剂残留、油脂易氧化酸败等不足，解决压榨法工艺繁琐、产率低、油品色泽不佳等缺点，在油脂加工及其综合利用方面有广泛的研究和应用[18]。

3.2 核桃蛋白质的提取

核桃蛋白提取方法众多，大部分核桃蛋白质可溶于水、盐溶液、稀酸和/或稀碱溶液，少部分与脂类等物质相结合的核桃蛋白质，可溶于乙醇、丙酮等有机溶剂；不同提取溶剂影响蛋白质的提取效率和纯度，但对核桃蛋白的结构影响不显著，较常用的方法为碱溶酸沉法[19-20]。随着科技进步，有研究采用超声波、微波等辅助技术对核桃蛋白的提取过程进行优化，增大提取效率的同时，缩短提取时间[21]。李婷等[22]通过超声辅助提取核桃蛋白，提取率超过70%，且所得核桃蛋白具有良好的生物活性，为其深加工制备核桃肽奠定基础。

3.3 核桃蛋白质的水解

3.3.1 核桃蛋白质的预处理技术

核桃蛋白含有紧密立体结构，酶切位点包藏于蛋白质内部，因此很难被蛋白酶充分水解，常规酶法水解蛋白质的水解度相对较低，且费时、条件苛刻[23]。为进一步提高蛋白质的水解效率和效果，可对核桃蛋白进行预处理，使其变性、酶切位点暴露，从而易与酶直接结合，有效提高水解效率。常见的预处理方法包括微波、超声波、热处理、冻融和超高压等技术。吕莹等[24]通过比较不同预处理方式对酶解脱脂核桃粕所得核桃肽抗氧化活性和得率的影响，发现加热、超声波、微波和碱提等预处理可提高脱脂核桃粕酶解效率，所得核桃肽的抗氧化活性和得率均高于未经预处理的产品。

3.3.2 核桃蛋白质的水解方法

生物活性肽制备通常采用直接分离提取法、化学合成法、微生物发酵法、蛋白质酶解法等。对于核桃肽制备应用较多的是蛋白酶解法及微生物发酵法，通过调整水解条件，获得不同水解度的水解产物，进而分离纯化得到核桃肽类物质。

3.3.2.1 蛋白酶解法

蛋白酶解法制备生物活性肽是采用蛋白酶水解蛋白质得到酶解液，再对其进行分离纯化得到生物活性肽的过程。此法操作简便、高效，且酶解过程容易控制，但需对所得酶解液进行系统的分离纯化。常用的蛋白酶包括动物蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶等）、植物蛋白酶（菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等）及微生物来源的酶（中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶等）。不同酶的最适酶解条件及酶切位点不同，因此，最终蛋白水解产物的组成和结构不同，在实际应用过程中需要根据蛋白质原料特性和生产制备目的对蛋白酶进行选择。常见的蛋白酶及其作用位点见表2[25]。

表2 常见蛋白酶的作用位点

蛋白酶解法制备核桃肽的关键是酶的选择，许磊[26]以水解度为评价指标，初步确定水解核桃蛋白的几种酶的酶解效果为：碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞风味蛋白酶＞胃蛋白酶。康玮丽等[27]采用Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶3种酶对核桃蛋白进行水解，发现水解能力差别较大，由大到小依次为Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。

此外，优化酶解条件对提取性质优良的核桃肽的重要性不容忽视。酶解条件如酶解温度、时间、最适pH、酶添加量等会影响生成肽链的长度、氨基酸顺序及游离氨基酸数量，最终影响产物生物活性。王纪辉等[28]采用中性蛋白酶水解核桃饼粕蛋白，并通过单因素试验和正交试验优化制备工艺，发现其最佳酶解条件为：酶解时间3 h、酶解温度38 ℃、pH 6.8、酶添加量4%、底物浓度2.4%，此时核桃多肽抗氧化活性最高，DPPH·清除率达92.35%。姜莉等[29]对木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白制备血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽的酶解条件进行优化，证明各因素对酶解物ACE抑制率的影响顺序为：pH＞温度＞底物浓度＞E/S（酶与底物浓度之比），并得到最佳酶解条件：pH 7.5、温度50 ℃、底物浓度30 g/kg、E/S 6 000 U/kg、酶解时间4 h。

为进一步提高酶解法制备核桃肽的效率及产品质量，提升酶解效率的方法有：1）固定化酶的使用，为提高生物酶制剂使用效率，科研工作者将酶进行固定化，从而实现连续化生产。薛洋等[30]利用海藻酸钙包埋中性蛋白酶Neutrase 0.8 L，在最适酶解条件下，将3.5 g/L固定化酶加入核桃蛋白溶液中，保温5 h后核桃蛋白水解度可达18.37%，且酶解物具有较强的还原能力，固定化酶活力回收率为57%。2）采用复合酶水解，多酶水解法制得肽的活性普遍优于单酶水解法，但由于不同种类的酶达到最高酶活力所需的温度、pH和酶解时间等条件不同，多酶复合水解比单酶水解稍复杂，如果不同种酶的适宜温度或pH差异较大，在一种酶水解后，须先灭酶处理再加入另一种酶[31]。李榕[32]的试验研究显示，先在温度55 ℃，pH 8.0，胰蛋白酶添加量2 000 U/g条件下水解 4.0 h，在温度50 ℃、pH 7.0、中性蛋白酶添加量3 100 U/g条件下水解 2.7 h，水解度为36.35%，氮回收率为92.53%；相比中性蛋白酶、胰蛋白酶单独水解核桃蛋白，水解度分别提高20.11%和17.79%，氮回收率分别提高29.20%和27.29%。3）酶解过程中采用强化技术，常用的强化酶解技术为超声、微波辅助技术。张兴灿[33]通过监测蛋白水解度，对蛋白酶在微波加热和水浴加热2种条件下水解核桃蛋白的效果进行比较，发现微波加热只需不到10 min即可达到所需效果，而水浴加热则需2 h。何秋实[34]利用超声辅助复合酶水解制备核桃抗氧化肽，最佳工艺条件下制备的核桃多肽DPPH自由基清除率显著提高，达84.94%，抗氧化能力与维生素E接近。

3.3.2.2 微生物发酵法

微生物发酵法制备活性肽是通过有益菌株自身产生的胞外酶系，有序降解大分子蛋白质，产生各种肽类。相比蛋白酶解法，此法不需额外添加其它蛋白酶，减少蛋白酶制备和纯化的过程。发酵法制备肽的研究主要集中在发酵菌种和原料筛选，以及发酵工艺革新与肽类活性开发，菌种多选择蛋白酶活力较强的细菌、霉菌及可除去腥味的酵母菌[35]。谢翠品等[36]利用黑曲霉对核桃粕进行发酵过程中产生的多种高效蛋白酶，水解核桃蛋白得到核桃多肽，具有蛋白酶源丰富、产量高、成本低等优点，发酵过程中可产生多种活性肽。高瑞雄等[37]采用纳豆芽孢杆菌对冷榨核桃粕进行液态发酵制备核桃多肽，其最优工艺条件为：底物质量浓度8 g/100 mL、接种量11%、起始pH 8.0、发酵温度33 ℃、发酵时间84 h，该条件下蛋白水解度与核桃多肽质量浓度均达到最大值，分别为37.5%和2.58 mg/mL。

但微生物代谢产生的酶系较复杂，水解副产物较多，而且受到菌种使用安全的限制，微生物发酵法难以展开推广。此外，化学水解（酸或碱）生产生物活性肽的过程中，会损坏L-型氨基酸，产生D-型氨基酸，同时也会导致不良物质（如赖-丙氨酸）形成，因此大幅降低所得水解物营养质量。而通过基因工程生产活性肽，不仅人力和物力投入较大，其安全性有待进一步探讨[38]。因此蛋白酶解法仍是制备包括核桃肽在内的各种活性肽的主要方法。

3.4 核桃肽分离纯化技术

国内外研究证明酶法制得低分子量核桃肽的许多生理功能在一定程度上强于分子量较高的核桃肽[39-40]。因此，通过控制酶解条件及后续分离纯化技术制备核桃寡肽，可进一步促进肽营养学发展。

但高活性核桃肽肽段氨基酸数目一般小于20，分子量小且比较接近，因此分离纯化难度较大。近年来，科研人员发现一系列新型分离技术，如柱层析法、高效液相色谱法、超滤膜分离法等[41-43]。柱层析法分离纯化核桃肽应用广泛，常用的层析柱包括离子交换柱、凝胶柱、大孔树脂层析柱等，使用不同的层析柱或联用多种层析柱，可分离不同分子量的组分。Gu等[44]通过Sephadex G-15结合C18反相柱进行核桃肽的分离纯化，筛选高抗氧化性的核桃肽并进行氨基酸测序，为进一步应用提供理论基础。Chen等[45]采用SP-825大孔树脂对核桃肽进行分离，通过蒸馏水和梯度乙醇进行洗脱，分离出3个组分的肽段，再经过中压液相系统进行进一步分离纯化得到具有改善学习记忆功能的核桃肽。李汉洋等[46]使用DA 201-C大孔树脂和Sephadex G-15葡聚糖凝胶对核桃粕蛋白酶解液进行分离纯化，发现经DA201-C大孔树脂分离的多肽组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（疏水性氨基酸含量依次增大）的抗氧化活性依次增大，组分Ⅲ经Sephadex G-15葡聚糖凝胶分离纯化得到a、b、c、d 4种分子量不同的多肽组分（分子量a＞b＞c＞d）；其中组分c（分子量400～700 Da）的·OH清除能力最强，并含有较多的谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸，与组分Ⅲ氨基酸组成相似。

除通过分子量的差异来分离纯化核桃肽之外，还可根据肽段的性质不同对核桃肽进行分离。吕莹等[47]通过铁离子螯合亲和层析法对核桃肽进行吸附，采用Na2HPO4进行梯度洗脱，得到3个抗氧化活性不同的组分，并发现核桃肽的铁结合能力越强，其抗氧化活性越高。

3.5 核桃肽的精制

酶解法制备活性肽最为普遍，但其制备过程中存在离子引入，并且发酵过程中难免发生美拉德反应而使肽带有颜色，水解过程中产生的疏水性肽还会使肽带有不良风味（苦味、臭味），限制肽的实际应用。因此，生产合格的核桃肽产品，必须进行精制处理，包括脱盐、脱色、脱苦、稳态化处理等操作。裴晓惠等[48]使用活性炭和β-环状糊精对核桃肽进行脱苦，并比较脱苦效果及脱苦后其ACE抑制率所受影响，发现核桃肽经40%的活性炭处理后ACE抑制活性差别较大，降低15.81%，而经22%的β-环状糊精脱苦处理后ACE抑制活性受影响较小，仅降低0.12%。成静等[49]以冷榨核桃粕为原料，复合酶解法制得核桃肽，采用β-环糊精作为包埋壁材对核桃肽进行微囊化工艺处理，得出微囊化核桃肽的最佳制备工艺：壁材与芯材比例10∶1，包埋温度60 ℃，包埋时间1 h。此时包埋率可达80.05%，90 d稳定性试验结果表明微囊化核桃肽水分增加速率明显变缓，提示其性质更加稳定、更易于存储。

3.6 核桃肽的结构鉴定和氨基酸测序

生物肽类一般由蛋白质经生物或化学方法降解制得，其活性取决于肽的结构，包括氨基酸含量、种类及连接顺序；对活性肽进行结构鉴定及氨基酸测序，有助于明确其构效关系，大大推动肽营养学发展。Zheng等[50]采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱，从脱脂核桃蛋白酶解物中分离纯化出ACE抑制肽，通过超高效液相色谱-质谱鉴定出2种具有ACE抑制活性的核桃寡肽序列，分别为Val-Gln-Thr-Leu和Leu-Gly-Tyr-Glu-Asn。Lü等[51]将制备纯化得到的铁螯合核桃肽经MALDI-TOF/TOF MS确定其分子量，通过nanoLC-MS/MS分析，最终确定其中2种主要肽段的氨基酸序列：Leu-Ala-Gly-Asn-Pro-Asp-Asp-Glu-Phe-Arg-Pro-Gln和Val-Glu-Asp-Glu-Leu-Val-Aal-Val-Val。

4 结语

核桃肽是一种混合物，不同制备方法所得核桃肽的结构和组成不同，因此所发挥的生理功能也不同[52-54]。虽有多种核桃肽制备方法，但微生物水解法副产物较多，且受到菌种使用安全的限制；化学水解法会损坏L-型氨基酸，并导致有害物质的形成，降低所得水解物的营养质量；基因工程耗费人力、物力较大，其安全性也存在疑问。因此蛋白酶解法仍是制备包括核桃肽在内的各种活性肽的主要方法。

对核桃肽制备工艺进一步革新，如探索更高效的蛋白水解酶、优化水解条件、精简制备流程及研发新型生产设备，可进一步提高核桃肽生产效率。此外，通过多种技术有机结合，揭示特征肽段的构效关系，并进行人工合成技术研发，有助于制备出更多具有高功能活性的核桃肽肽段，甚至阐明特定氨基酸序列肽段对应的生物学功能，指导企业生产开发出适合特定人群及使用方式的核桃肽类保健产品，更加高效地应用于多种疾病防治，具有重要现实意义。