枸杞提取液主要成分含量与体外抗氧化活性的相关性

周旋，梁晓婕，王亚军，安巍，李越鲲*

宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所（银川 750002）

枸杞（Lycium chinense）为茄科多年生落叶灌木，其果实又称枸杞子，是中国传统药食同源中药材。枸杞子味甘、性平，归肝、肾经，具滋补肝肾、益精明目、延缓衰老等功效[1]。现代研究发现它有降低血糖含量、防止动脉硬化、抗癌、增强机体免疫力、防止老年痴呆症等作用[2-3]。这些药用功效多与枸杞的抗氧化成分有关。

前人对枸杞抗氧化活性的研究主要集中在枸杞提取液及枸杞多糖、黄酮等类成分，对于主要活性成分之间的协同作用研究较少。试验以亲缘关系相近、立地条件和田间管理方式相同的“宁杞1号”“大麻叶”“小麻叶”3个枸杞主流栽培品种为材料，研究提取液浓度及枸杞多糖、黄酮、甜菜碱3种主要功效成分含量与抗氧化活性的相关性，旨在分析主要活性成分与体外抗氧化活性是否存在相关性以及哪种化学成分起主要作用，为进一步揭示枸杞抗氧化机理、研发枸杞功能性食品提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 枸杞材料

供试的“宁杞1号”“大麻叶”“小麻叶”3个枸杞栽培品种，亲缘关系相近，树龄相同、栽培及田间管理方式一致，均来自宁夏农林科学院国家枸杞工程技术研究中心枸杞种质资源圃（38°38′49″ N，106°09′10″ E），分别采集3个枸杞品种的前3批果实作为供试样品，样品编号见表1。

表1 样品编号

1.1.2 供试动物

昆明种小鼠，清洁级；性别，雄性；体质量，25±2 g；来源，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0004，动物合格证号11401300007838。

1.2 试验方法

1.2.1 待测液Ⅰ制备及黄酮含量的测定

将枸杞子干燥品粉碎，分别精密称取约10 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL 80%乙醇溶液，超声处理2次，每次30 min，过滤，滤液置于100 mL量瓶中，残渣用80%乙醇溶液洗涤3次，合并滤液，加80%乙醇溶液至刻度，摇匀，得待测液Ⅰ，用于测定黄酮含量。

黄酮含量的测定采用紫外可见分光光度法，参考孔令明等[4]的方法并改进。

1.2.2 待测液Ⅱ制备及枸杞多糖含量的测定

上述残渣连同滤纸置具塞锥形瓶中，加25 mL蒸馏水，在80 ℃水浴中超声处理2次，每次40 min，趁热滤过，滤液置100 mL量瓶中，残渣用热蒸馏水数次洗涤，将洗液倒入滤液中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得待测液Ⅱ。用于测定多糖含量。

多糖含量的测定采用紫外可见分光光度法，参考GB/T 18672—2014。

1.2.3 待测液Ⅲ制备及甜菜碱含量的测定

取待测液Ⅰ与待测液Ⅱ，各50 mL，合并，摇匀，得待测液Ⅲ。用于测定甜菜碱含量及体外抗氧化活性。

甜菜碱含量测定采用高效液相色谱法，参考杨宗学等[5]方法进行测定。

1.2.4 体外抗氧化活性不同浓度供试液的制备

分别取50 mL待测液Ⅲ，置水浴上浓缩至无醇味，约10 mL，转移至50 mL量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，作为小鼠体外实验原液。将原液用生理盐水按1∶2依次稀释成50%，25%，12.5%和6.25%的混悬液，作为不同浓度供试液。

1.2.5 对小鼠血清羟自由基清除能力的影响

取50只小鼠，眼眶取血，分离血清，取0.1 mL血清，分别用原液、不同浓度供试液、生理盐水稀释20倍，于37 ℃温浴1 h，吸取0.2 mL，按照羟自由基测定试剂盒说明书方法，在550 nm波长处读取各孔吸光度（A）[6-7]。每个样品重复3次。抑制羟自由基能力按式（1）计算。

抑制羟自由基能力（U/mL）=标准品浓度×（A对照-A测定）×取样量/[（A标准-A空白）×稀释倍数] （1）

1.2.6 对小鼠红细胞的保护作用

取10只小鼠，小鼠眼眶取血，置肝素抗凝管中，用生理盐水以2 000 r/min离心15 min，洗涤3次，去除血浆后，用生理盐水配制0.5%的红细胞悬液，于4 ℃保存，备用。

取1 mL红细胞悬液，分别加入原液、不同浓度供试溶液、生理盐水，各0.1 mL，混匀，再加入0.1 mL 0.1 moL/L H2O2，于37 ℃温浴1 h，用4 mL生理盐水稀释，以2 000 r/min离心5 min，取上清液，在415 nm波长处读取吸光度（A1）。对照管以0.1 mL生理盐水替代样品液，其余操作同样品管，测得对照管吸光度（A0）[8]，按式（2）计算溶血抑制率。每个样品重复3次。

1.2.7 对小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成的影响

取6只小鼠，脱臼处死，剖取肝脏，用0～4 ℃生理盐水洗净血渍，滤纸吸干后称其质量，按1∶9（g/mL）用冰生理盐水在冰水浴中将肝组织制成匀浆液，以3 500 r/min离心15 min，取上清液即为10%肝匀浆液。采用双缩脲法测定蛋白量（mg prot/mL）。

取0.2 mL 10%肝匀浆液，分别加入原液、不同浓度供试液、生理盐水各0.1 mL于试管中，混匀，作为测定管，同时以生理盐水替代样品溶液作为空白样品，于37 ℃温浴1 h，冷却，吸取0.1 mL，按照过氧化产物MDA测定试剂盒说明书方法测定[6,9]，在532 nm波长处读取吸光度（A）。每个样品重复测定3次。肝MDA含量按式（3）计算。

1.2.8 数据处理与分析

应用Excel 2013和SPSS 23.0软件对试验原始数据进行处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 枸杞子提取液对小鼠血清羟自由基清除能力的影响

由图1可知，枸杞子提取液浓度在6.25%～25%之间，其对小鼠血清羟自由基清除能力呈上升的趋势；枸杞子提取液浓度达到25%以后，其对小鼠血清羟自由基清除能力又呈迅速下降的趋势，整体呈抛物线型变化。提取液浓度在12.5%～50%之间，其具有较好的清除羟自由基能力，且不同品种枸杞提取液变化趋势一致。

图1 枸杞子提取液对小鼠血清羟自由基清除能力的影响

2.2 枸杞子提取液对H2O2致小鼠红细胞溶血抑制率的影响

由图2可知，随着枸杞子提取液浓度的增大，小鼠红细胞溶血抑制率呈上升趋势，即枸杞子提取液对小鼠红细胞溶血抑制率的影响随着其浓度的增大而增强，呈明显的量效关系。说明不同品种枸杞子提取液对小鼠红细胞均有明显的保护作用。

图2 枸杞子提取液对小鼠红细胞保护作用

2.3 枸杞子提取液对小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成的影响

由图3可知，随着枸杞子提取液浓度的增大，其对小鼠肝组织脂质过氧化MDA的影响呈先下降后上升的趋势。除样品4在浓度25%对小鼠肝组织脂质过氧化MDA的影响达到最低值外，其他样品提取液浓度在12.5%～50%之间差异不显著。枸杞子提取液浓度在50%～100%之间，小鼠肝组织脂质过氧化作用被抑制性明显增强，说明提取液原液抑制肝组织生成MDA的能力较好。

图3 枸杞子提取液对小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成的影响

2.4 提取液主要活性成分含量与体外抗氧化活性的相关性

为探究枸杞提取液主要活性成分含量与体外抗氧化活性指标之间的关系，采用双变量相关分析的方法，分析两者之间的相关性，详见表2。

表2表明，枸杞多糖与抑制羟自由基能力具有显著正相关关系（r=0.771，p＜0.05），与抑制小鼠肝组织MDA生成能力具有极显著正相关关系（R=0.812，p＜0.01）；即随着枸杞提取液中多糖含量的增加，其抑制羟自由基能力不断增强，抑制MDA生成的能力也不断增大；通过一元线性回归分析得到多糖含量与抑制羟自由基能力的线性方程：y=2.912x+200.3，R2=0.594（图4）；抑制小鼠肝组织MDA生成能力的线性方程为：y=0.014x+0.428，R2=0.660（图5）。而枸杞提取液中枸杞多糖与溶血抑制率之间不具有显著相关性（p＞0.05），两者之间存在负相关关系（表1）。

同时，从表2中还可以看出枸杞提取液中黄酮、甜菜碱与3个体外抗氧化活性指标互相之间均不具有显著相关性（p＞0.05）；其中：黄酮与抑制羟自由基能力和抑制MDA生成能力存在负相关关系，与溶血抑制率存在正相关关系；甜菜碱与3个体外抗氧化活性指标均具有负相关关系。

另外，从表2还可以看出，体外抗氧化活性与3种成分之一呈正相关关系，而与另外2种呈负相关关系，也就是说体外抗氧化活性由其中一种成分决定，3种成分之间是否存在拮抗作用及其作用机制，有待进一步研究。

表2 枸杞提取液主要活性成分含量与体外抗氧化活性的相关系数

图4 枸杞多糖含量与清除小鼠血清羟自由基能力的相关性

图5 枸杞多糖含量与抑制小鼠肝组织MDA生成的相关性

3 结论与讨论

近年来，诸多研究结果表明人工合成抗氧化剂副作用多，影响人体健康，对人体肝、脾、肺均会产生有不利作用，甚至会诱发恶性肿瘤等。天然抗氧化剂成分毒性远低于人工合成的抗氧化剂。因此，天然抗氧化剂的研究受到研究者的青睐，尤其是中草药提取物的抗氧化作用受到国内外学者的广泛关注[10-13]。

研究表明，贯穿枸杞延缓衰老、抗脂肪肝、增强肌体免疫力等多种功能的是枸杞的抗氧化功能，因为由活性氧导致的氧化胁迫和氧化损伤是造成人体多种器官疾病和机体衰老的一个重要原因[14-15]。

试验研究了亲缘关系最近，立地条件、管理措施相同的不同枸杞品种、不同批次样品提取液浓度与抗氧化活性的关系。结果表明，在一定浓度范围内枸杞提取液有清除羟自由基、保护红细胞、抑制脂质过氧化的作用，枸杞提取液浓度与抗氧化活性存在一定的量效关系，且不同品种、不同批次枸杞变化趋势一致。鉴于可以规避外界因素对试验结果的影响。试验进一步分析了主要活性成分枸杞多糖、黄酮、甜菜碱与抗氧化活性之间的相关性，结果表明，枸杞多糖含量与清除小鼠血清羟自由基能力呈显著的正相关关系，与抑制肝组织生成MDA能力呈极显著正相关关系，这与前人对枸杞多糖单一成分的研究结果一致[16]。另外，体外抗氧化活性均与其中一种成分含量呈正相关关系，而与另外2种成分含量呈负相关关系，3种主要活性成分是否存在拮抗作用及具体的作用机制有待于进一步研究。

此次试验对于枸杞的有效开发和利用具有重要的参考价值，对于枸杞天然抗氧化剂及功能食品的开发具有十分重要的理论价值和实际价值。另外，枸杞多糖、黄酮、甜菜碱与其他活性成分如类胡萝卜素、VC等多种成分的交互作用有待进一步研究。