黑虎掌菌多糖脱色工艺及其抗氧化活性

冉靓，周婵媛，张桂玲，李素莲，蒙进兰

1. 贵阳学院化学与材料工程学院（贵阳 550005）；2. 核工业240研究所（沈阳 110000）

黑虎掌菌（Sarcodon aspratum（Berk.）S. Ito）是一种分布于我国云南、四川、西藏、贵州等地的食用真菌。营养学的研究表明，该菌营养较为均衡，含有人体所需的8种必需氨基酸和Mg、Mn、Fe、Zn等多种矿物质元素[1]。化学成分的研究显示，新鲜黑虎掌菌中含有脑苷脂、核苷、多羟基麦角甾醇等化合物，脂肪烃醇类、芳香性杂环类等42种挥发性芳香物质，其精油中含有2-甲基-己酸等77种化学成分[2-5]。相关研究提示，黑虎掌菌有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、提高免疫力等多种生物学活性[6-9]。近年来，多糖作为一种生物活性大分子而备受关注，有研究者对黑虎掌菌多糖的提取工艺、结构组成、活性等开展了不少研究[10-12]，但对其多糖纯化工艺的研究报道较少，而纯度是影响多糖产品质量的关键因素之一，因此，试验针对黑虎掌菌多糖纯化过程中的脱色环节进行了相关研究，通过正交试验优化黑虎掌菌多糖的树脂脱色工艺，并与其他脱色方案进行比较，同时比较脱色前后样品的总抗氧化能力，以期为黑虎掌菌多糖的纯化和体外抗氧化活性研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

黑虎掌菌（贵州聚特工贸有限公司）。

葡萄糖、无水乙醇、重蒸苯酚、浓硫酸、双氧水（30%）、盐酸、氢氧化钠等，以上试剂均为分析纯，试验用水为去离子水。

大孔吸附树脂：D101、HPD 450、HPD 600；大孔阳离子交换树脂：D001、D113；大孔阴离子交换树脂：D202、D301。

1.2 主要仪器与设备

FZ102粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SC-3616低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；101-2AB电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHA-B恒温震荡器（常州澳华仪器有限公司）；FA1104电子天平（上海舜宇恒平科技仪器有限公司）；Blue Star A紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科技仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 黑虎掌菌多糖的制备

称取适量黑虎掌菌干品，于80 ℃水浴中，以20∶1（mL/g）的液料比，提取两次。合并滤液，浓缩后，加无水乙醇至浓缩液中，使混合液中乙醇体积分数达到80%以上，静置过夜后离心，收集沉淀，在60 ℃下真空干燥沉淀，得黑虎掌菌粗多糖。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 多糖保留率的测定

用硫酸-苯酚法测定脱色前后样品溶液中的总糖含量，按式（1）计算多糖保留率[13]。

1.3.2.2 脱色率的测定

在200～800 nm波长处对黑虎掌菌多糖溶液进行扫描，确定360 nm为后续测定波长，在该波长下研究溶液的脱色情况，按式（2）计算脱色率[14]。

1.3.3 大孔树脂的筛选

1.3.3.1 树脂的预处理

按文献[15]将树脂进行预处理，备用。

1.3.3.2 树脂的筛选

配制1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，按10∶1（mL/g）的液料比加入预处理好的树脂，在25 ℃，200 r/min条件下振荡24 h，取上清液，过滤后用1.3.2的方法测定。

1.3.4 优选树脂的脱色优化试验

1.3.4.1 单因素试验

选取树脂加入量、温度、时间、样品质量浓度、样品pH为考察对象，每次试验时，固定其中四个因素，研究剩余因素在不同水平下的试验结果，用1.3.2的方法测定。

树脂加入量对脱色效果的影响：分别称取40.0，20.0，10.0，5.0和2.5 g处理后的D202树脂，加入100.0 mL质量浓度为1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖样品溶液中，在100 r/min，30 ℃下振荡脱色2 h。

温度对脱色效果的影响：称取5.0 g处理好的D202树脂，加入50.0 mL质量浓度为1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，分别在20，30，40，50，60，70和80 ℃的恒温水浴中振荡2 h。

时间对脱色效果的影响：称取5.0 g处理好的D202树脂，加入50.0 mL质量浓度为1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，分别置于30 ℃，100 r/min条件下1，2，3，4和5 h。

样品质量浓度对脱色效果的影响：分别称取5.0 g干燥后的树脂，加入质量浓度为0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 mg/mL的多糖溶液中，在30 ℃，100 r/min的条件下，振荡脱色2 h。

样品pH对脱色效果的影响：分别称取5.0 g树脂，加入50.0 mL pH 3.00，5.00，7.22（原始溶液pH），9.00和11.00的1.0 mg/mL黑虎掌菌多糖溶液中，在30℃，100 r/min下振荡脱色2 h。

1.3.4.2 正交试验[16]

在单因素试验结果基础上，优选因素水平，依据L9(34)表进行试验，用1.3.2的方法测定，按综合评分=脱色率×0.5+多糖保留率×0.5进行计算，根据结果进行工艺优化。

1.3.4.3 验证试验

根据正交试验结果进行验证试验，平行3次。

1.3.5 不同脱色方案的比较试验

采用3种不同脱色方案对黑虎掌菌多糖溶液进行脱色，以综合评分为评价指标，采用最小显著性法（LSD法）进行多重比较分析。

1.3.5.1 树脂法脱色

取3份4.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，按优化条件进行试验，用1.3.2的方法测定。

1.3.5.2 活性炭脱色

取3份4.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，每份30.0 mL，分别加入3.0 g颗粒活性炭，置于60 ℃，100 r/min的水浴恒温振荡器中，振荡3 h后取出，用1.3.2的方法测定[17]。

1.3.5.3 双氧水脱色

取3份4.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，每份25.0 mL，分别加入10.0 mL 30%的双氧水，置于60 ℃，100 r/min的水浴恒温振荡器中，振荡3 h后取出，用1.3.2 的方法测定[18]。

1.3.6 样品脱色前后的抗氧化性试验

采用脱色、醇沉工艺制备脱色后样品，采用FRAP法评价脱色前后黑虎掌菌多糖的抗氧化活性[19]。

2 结果与分析

2.1 筛选树脂结果

用1.3.3.2中的方法对7种不同类型树脂进行筛选，结果如表1所示。仅就脱色率而言，在所有树脂中，阳离子交换树脂（D001、D113）的脱色效果最差，阴离子交换树脂（D202和D301）和大孔吸附树脂（D101，HPD 450和HPD 600）的脱色效果相当，说明采用吸附的原理或离子交换的原理，样品中的色素有较好的去除。但是，结合多糖保留率考虑，发现离子交换的选择性优于吸附，所以阴离子交换树脂比大孔吸附树脂对多糖的保留情况整体较好。综合考虑，优选D202对黑虎掌菌多糖溶液进行脱色。

表1 不同树脂脱色效果比较

2.2 树脂法脱色的优化试验结果

2.2.1 单因素试验结果

2.2.1.1 树脂加入量对脱色效果的影响

由图1可见，随着树脂加入量的增加，溶液脱色程度呈明显增大趋势，由39.80%增加到92.06%，但是多糖的保留率却随着该比值的增大而逐渐下降，由90.64%下降到49.09%；在20～40 g/100 mL之间，脱色率和多糖保留率的变化均较为平缓。综合考虑，可将10 g/100 mL的树脂加入量固定为后续试验的条件。

图1 树脂加入量对脱色效果的影响

2.2.1.2 温度对脱色效果的影响

由图2可知，样品溶液的脱色程度随着温度的增加而逐渐升高，由64.84%增加到90.16%；而多糖保留率随温度的改变而变化较大，其中在60，50和40 ℃这3个温度下，多糖的保留率均较高，而在高温条件下，多糖保留率较低，这可能与多糖在高温下的稳定性有关。综合分析，可将60 ℃固定为后续试验的条件。

2.2.1.3 时间对脱色效果的影响

由图3可知，随着时间的延长，黑虎掌菌多糖溶液的脱色率增大，由75.27%增加到86.84%，而多糖的保留率却减小到45.81%。在1～3 h内，树脂对色素的吸附呈一定增加的趋势，而多糖的保留程度也较好。故选择1，2和3 h作为正交试验的3个水平点。

2.2.1.4 样品质量浓度对脱色效果的影响

由图4可见，随着黑虎掌菌多糖溶液浓度的升高，脱色程度逐渐增大，说明浓度对脱色有一定的影响。在1.0，2.0和4.0 mg/mL这3个浓度下，脱色效果比较好，多糖的保留率也较大，为66.35～93.29%。因此，可以选择1.0，2.0和4.0 mg/mL这3个浓度作为正交试验的3个水平。

图2 温度对脱色效果的影响

图3 时间对脱色效果的影响

图4 样品质量浓度对脱色效果的影响

2.2.1.5 样品pH对脱色效果的影响

由图5可见，脱色率曲线随pH变化的波动比较大，D202在过酸和过碱的情况下对色素的吸附能力明显减弱。在pH为5.00，7.22和9.00这3个条件下脱色率均较大，多糖的保留率也相对较高，所以选择pH为5.00，7.22和9.00作为正交试验的3个水平点。

2.2.2 正交试验及验证试验结果

根据单因素试验的结果，采用L9(34)表安排试验，试验结果如表2和表3所示。根据方差分析的结果，该模型非常显著，各因素对黑虎掌菌多糖脱色效果的影响次序为：试样质量浓度＞pH＞时间，其中试样质量浓度和pH的影响非常显著。多糖脱色的优化工艺条件为：多糖质量浓度4.0 mg/mL，多糖溶液pH 9.00，时间3 h。按此优化条件进行验证试验，平行3组，多糖脱色率为91.75%±0.70%，多糖保留率为55.84%±6.64%。

图5 样品pH对脱色效果的影响

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

2.3 不同脱色方案的比较试验结果

借助1.3.5的方法比较不同脱色方案处理黑虎掌菌多糖的效果，经LSD法分析，结果如表4所示。树脂法与活性炭法、过氧化氢法比较，它们对样品的脱色处理有显著差异（p＜0.05），而活性炭法和过氧化氢法的处理效果在统计学上无明显差异，三种脱色方案的优劣顺序为：树脂法＞活性炭法＞过氧化氢法。

表4 三种脱色方案的结果比较（n=3）

2.4 样品抗氧化性试验结果

按1.3.6中的方法进行试验，结果如图6所示。在样品浓度为0.5～2.5 mg/mL的范围内，脱色前后的黑虎掌菌多糖均表现出抗氧化性，且两个样品的抗氧化能力均呈现出一定的量效关系，脱色前多糖样品的抗氧化性略强。

图6 样品抗氧化性试验结果

3 结论与讨论

此次试验对黑虎掌菌多糖的脱色工艺进行了优化，并比较了多糖在脱色前后抗氧化性能的差异，结果显示：

1) 用不同类型的大孔树脂对黑虎掌菌多糖进行脱色处理，均能表现出脱色效果，但效果有差异。这种差异可能与树脂的作用原理不同有关，不同极性的大孔吸附树脂主要基于极性不同进行物理吸附，而离子交换树脂对物质的吸附主要源于离子交换。此次试验中，样品的色素主要带有负电荷，故所选的7种树脂中，阴离子交换树脂的选择性更好，整体表现较好，D202树脂对试验样品的脱色率可达75.45%，多糖保留率为69.91%，整体效果较佳。

2) 用D202树脂对黑虎掌菌多糖脱色的最佳工艺条件为：温度60 ℃，树脂加入量10 g/100 mL，多糖溶液pH 9.00，质量浓度4.0 mg/mL，时间3 h。此条件下的多糖脱色率为91.75%±0.70%，多糖保留率为55.84%±6.64%。结果说明，树脂对多糖的脱色过程，从动态平衡的角度考虑，受传统热力学因素的影响，但不能忽略样品中目标成分在相关条件下的稳定性，同时还需结合树脂作用的原理考虑，设置有利于树脂发挥作用的试验条件。

3) 对比了3种脱色方案（过氧化氢法、活性炭法、树脂法）对黑虎掌菌多糖的处理效果，综合评分法表明树脂法明显优于过氧化氢法和活性炭法。这可能是因为此次试验中所选用树脂的选择性相对较高，而过氧化氢法主要是化学氧化脱色，活性炭法主要是物理吸附脱色，这两种方式虽然能够去除色素等杂质，但也能较大程度地影响样品中的目标成分多糖。

4) 脱色前后的黑虎掌菌多糖均有一定的抗氧化活性。该结果在一定程度上说明此次试验中色素成分对样品的抗氧化性贡献较小，黑虎掌菌多糖本身具有抗氧化活性，但具体作用的机制和方式需要进一步试验的研究。

综上所述，D202可用于黑虎掌菌多糖的脱色处理，该方法对仪器设备要求较低，工艺条件温和，脱色率较高，多糖损失较少，且脱色前后样品的抗氧化活性变化较小，能够在一定程度上改善黑虎掌菌多糖的品质，便于该样品的后续研究。