响应面优化丑橘皮精油提取及其抑菌性

樊迎，王雪婷，郭雅娴，刘畅，董鹏飞

山西农业大学信息学院（晋中 030800）

丑橘又名丑柑，属于杂柑的一种，学名“不知火”，是芸香科柑橘属植物的一种新型品种水果。因其口感极佳，已成为近年来深受消费者喜爱的柑橘类水果。皮作为柑橘类水果的非食用部位，占鲜果质量的20%～40%[1]。柑橘类水果皮中含有丰富的精油、微量元素、果胶、橙色素等[2]。其中，柑橘类水果皮精油具有令人愉悦的天然柑橘香气，不仅气味清新怡人，而且具有抑菌[3]、护肺[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[5]、保鲜[6]等作用，被称为“液体黄金”，已被广泛应用于医药、化妆品及食品工业中。

目前，从柑橘类水果的果皮中提取精油的方法主要有压榨法[7]、溶剂浸提法[8]、水蒸气蒸馏法[9]、超（亚）临界流体萃取法[10-11]、超高压法[12]等，也有不少学者会同时辅以超声[13]、微波[14]、酶解[15]等手段，以提高精油提取的效率和品质。研究表明，采用溶剂浸提法提取的桔皮精油，香味浓，柠檬烯含量高[16]，且此法操作简便、成本低，有较大的推广价值。鲜见有丑橘皮精油提取的相关报道。试验采用超声波辅助溶剂萃取法提取丑橘皮精油，通过响应面分析法优化得到提取丑橘皮精油的最佳工艺，并对其抑菌性进行初探，以期为丑橘资源的综合利用、精深加工及应用提供参考数据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料与试剂

新鲜丑橘，市售。试剂：石油醚、95%乙醇、正己烷，均为AR，天津市北辰方正试剂厂；牛肉膏、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；菌种：细菌（枯草芽孢杆菌），山西农业大学信息学院实验室保藏；酵母菌（安琪高活性干酵母），购于市场；霉菌（青霉），分离自发霉的橘皮表面。

1.2 试验设备与仪器

CG-8200多功能研磨机，中山市长柏电器实业有限公司；BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SB-3200DT超声波仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；R206D真空旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SW-CJ-2F超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DH2500电热恒温培养箱，天津市通利信达仪器厂；等。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

丑橘洗净、去皮，将丑橘皮分批次放入烘箱中，于45 ℃烘干至恒质量。用多功能研磨机粉碎，过40目筛，得到丑橘皮粉，置于无菌密封袋中备用。

1.3.2 丑橘皮精油提取工艺

用电子天平称取若干份10.00 g的丑橘皮粉，按照一定的料液比加入提取溶剂，超声功率设置为100 W[17]，在一定温度下浸提一段时间，过滤得到丑橘皮精油提取液。将提取液置于旋转蒸发器中进行减压蒸馏分离溶剂后，得到丑橘皮精油，其得率按照式（1）计算：

1.3.3 提取条件的研究

以丑橘皮精油得率为考察指标，先研究提取溶剂（正己烷、95%乙醇、石油醚）对提取效果的影响，确定出最优提取溶剂，后续试验均以此溶剂作为提取剂；然后研究超声浸提温度、提取时间、料液比这3个因素对丑橘皮精油提取得率的影响。固定初始条件：浸提温度45 ℃、提取时间50 min、料液比1∶6（g·mL-1）。所有试验均进行3次平行操作，取平均值进行分析。

1.3.4 响应面法优化试验

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken试验原理，以丑橘皮精油得率为响应值，浸提温度（A）、提取时间（B）和料液比（C）为3个试验因素，进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验。运用Design-Expert V 8.0.6软件系统进行响应面分析，建立回归模型，确定丑橘皮精油的超声辅助提取法的最佳工艺参数。试验各因素水平及编码见表1。

表1 试验因素水平及编码

1.3.5 丑橘皮精油抑菌性试验

1.3.5.1 菌悬液的制备

细菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养，酵母菌和霉菌用PDA培养基培养。取受试菌种接种到提前制备好的液体培养基中活化24 h，重复2次后，取活化好的菌种，配成106～108个/mL的菌悬液，备用。

1.3.5.2 抑菌效力测定[18]

采用滤纸片扩散法测定细菌的抑菌效力，先分别取0.1 mL枯草芽胞杆菌和酵母菌的菌悬液、青霉的孢悬液，倒入培养皿中涂抹均匀，直到感觉有黏稠感产生。取直径大小为6 mm无菌滤纸小圆片，在丑橘皮精油中充分浸泡12 h后放置于平板中，以6 mm未浸泡过丑橘皮精油的滤纸片放入含菌培养皿中作为对照，所有操作均进行3次重复。酵母菌和青霉在28 ℃下培养48 h，枯草芽胞杆菌在37 ℃下培养24 h后，测抑菌圈直径并取平均值。敏感度判定标准[19]：抑菌圈直径大于20 mm，极敏感；15～20 mm，高敏感；10～15 mm，中敏感；8～10 mm，低敏感；小于7 mm，不敏感。

2 结果与分析

2.1 丑橘皮精油提取的单因素试验结果

2.1.1 提取溶剂的确定

分别用3种有机溶剂来提取丑橘皮精油，结果见图1。

图1表明，用所选的3种溶剂提取丑橘皮精油，得率由高及低依次为：正己烷＞石油醚＞95%乙醇。95%乙醇的提取效果及精油品质均不佳。石油醚和正己烷是较好的提取剂，二者的精油得率均较高，且差异不大。石油醚提取所得精油为橙黄色、澄清透明，正己烷提取得到的精油为黄色，稍显黏稠，澄清度不及前者。加之石油醚具有价格优势，故选用石油醚作为后续试验的提取溶剂。

2.1.2 超声浸提温度对丑橘皮精油得率的影响

运用上组定好的提取溶剂，在其他条件一致的情况下，改变丑橘皮粉的浸提温度，结果见图2。

从图2可知，随着温度升高，丑橘皮精油得率逐渐升高，当浸提温度为55 ℃时，丑橘精油得率最高，再升高温度，得率不再呈原有的缓慢平缓升高趋势，超过55 ℃后，反而呈现出微下降趋势。因为精油易挥发，提高浸提温度并不能一直提高丑橘皮精油得率，超过一定温度后，丑橘皮精油挥发散失量增大，得率由此而降低。图2折线总趋势趋于平缓，说明温度对丑橘皮精油得率影响稍弱。最佳浸提温度为55 ℃。

图1 不同提取溶剂对丑橘皮精油提取效果的影响

图2 超声浸提温度对丑橘皮精油得率的影响

2.1.3 超声时间对丑橘皮精油得率的影响

在前2组确定的提取溶剂和浸提温度条件下，只改变超声辅助提取的时长，所得丑橘皮精油得率如图3所示。

从图3可知，随着超声辅助提取时间的延长，丑橘皮精油得率有较大幅度的升高，当超声波提取时间为60 min时，丑橘精油得率最高，随后继续增加提取时间，丑橘皮精油得率反而略有下降，这可能是因为超声处理时间过短，丑橘皮细胞壁破裂及胞内热效应程度低，精油无法完全溶出，随着超声处理时间的延长，丑橘皮细胞壁破裂程度提高，精油充分溶出，但如果超声处理时间过长，则其升温效应会导致部分丑橘皮精油挥发，导致得率下降[20]。因此超声最佳处理时间为60 min。

2.1.4 料液比对丑橘皮精油得率的影响

在前3组确定的溶剂、浸提温度和超声时间条件下，研究不同料液比对丑橘皮精油提取得率的影响，结果如图4所示。

图4显示，丑橘皮粉与石油醚的比例在1∶2～1∶6（g·mL-1）的范围内，丑橘皮精油得率随着料液比的增加而升高，这主要是因为对于一定量的丑橘皮粉，增加料液比，丑橘皮粉与石油醚接触面的浓度差就越大，越有利于丑橘精油从细胞组织中脱离出来；当料液比大于1∶6（g·mL-1）时，精油得率并没持续上升，反而出现下降的情形，这是由于继续增加溶剂用量，部分超声波辐射能会被溶剂吸收[21]，同时，其他脂溶性成分竞争溶解量增加，导致丑橘皮精油的得率降低。综上所述，料液比取1∶6（g·mL-1）最合适。

图3 超声时间对丑橘皮精油得率的影响

图4 料液比对丑橘皮精油得率的影响

2.2 响应面优化结果

综合单因素试验结果，在Box-Behnken试验原理的基础上，以超声辅助丑橘皮精油提取的浸提温度（A）、提取时间（B）和料液比（C）为自变量，丑橘皮精油得率（Y）为响应值，用Design-Expert V 8.0.6软件进行三因素三水平的二次多项式回归拟合分析。试验设计及结果见表2。

2.2.1 回归模型的建立与方差分析

应用Design-Expert V 8.0.6软件对表2中的丑橘皮精油得率结果进行多元回归拟合分析，所建立的二次回归模型为：Y=2.548+0.118 75A+0.255B+0.226 25C-0.027 5AB+0.015AC+0.062 5BC-0.164A2-0.381 5B2-0.204C2。对此模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，回归模型的F值为87.84、p值＜0.01，表明模型显著，失拟项p值=0.095 6＞0.05，说明失拟项差异不显著，可知此模型可很好地描述丑橘皮精油得率和各提取因素之间的关系；同时，此模型的决定系数R2=0.991 2，调整系数AdjR2=0.979 9，表明此模型拟合程度好，可以解释响应面中99.12%的可变性，总变异中只有2.01%不能用此模型解释。故可认为所选用的二次回归模型是合适的，未知因素对试验结果的影响很小，可以较准确地预测丑橘皮精油的提取得率。F值越大，说明此因素对丑橘皮精油提取得率的影响越大，故可判断出所考察的这3种因素影响大小顺序为：提取时间（B）＞料液比（C）＞浸提温度（A）。模型中一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2均对丑橘皮精油提取得率的影响达到极显著水平，交互项BC对其影响达到显著水平，说明超声辅助提取时间和料液比2个因素对丑橘皮精油提取得率的影响并非简单的线性关系，有必要做交互作用分析。

表2 响应面试验设计及结果

表3 丑橘皮精油得率的方差分析表

通过对模型方程求导，得到方程的最优解即丑橘皮精油的预测得率的最大值（2.685%），此值对应的各因素最佳条件分别为：浸提温度（A）56.3 ℃、提取时间（B）61.3 min、料液比（C）1∶6.13（g·mL-1）。

2.2.2 最佳提取工艺验证

为了验证丑橘皮精油提取的最佳工艺条件，同时考虑实际操作的可行性，将最佳提取条件设置为提取温度56 ℃、超声辅助提取时间61 min、固液比1∶6.1（g·mL-1），在此条件下重复验证3次所得到的丑橘皮精油的得率为2.68%±0.09%，与预测值十分接近，说明此二次多项式回归方程对丑橘皮精油得率的预测是可靠的，此试验条件可用于超声辅助丑橘皮精油的提取优化。

2.2.3 响应面及交互作用分析

响应曲面图和等高线图是经过软件绘制的，分别为三维立体曲面图和二维平面生成的等高线图，可直观反映出各个因素的单独作用效果和因素交互作用结果，如图5～图7所示。

图5 浸提温度和提取时间对丑橘精皮油得率的交互作用

图6 浸提温度和料液比对丑橘精皮油得率的交互作用

图7 浸提时间和料液比对丑橘精皮油得率的交互作用

观察图5～图7的响应面图，发现均为开口向下的曲面图，显示为负值，形如山丘一样中间拱起，而四周相对较低的曲面，代表着存在有极大值[19]。比较3个曲面图，可以看出提取时间的曲线最陡峭，表明其对丑橘皮精油提取得率的影响最大，这与2.2.1中方差分析结果相一致；通过比较3个等高线图，发现提取时间和料液比的交互作用最显著，表现为等高线呈现明显的椭圆形且最密集。而其他2个等高线图则更接近于圆形，且排列不太密集，对应的响应面图线也较为平缓，说明浸提温度和料液比、浸提温度和提取时间之间的交互作用对丑橘皮精油得率的影响不显著。

2.3 丑橘皮精油的抑菌性能

试验用枯草芽孢杆菌、酵母菌和青霉3种供试菌种作为研究丑橘皮精油抑菌性的对象，考察丑橘精油的抑菌能力。由表4可知，丑橘皮精油对于各类微生物均有着抑制作用，并产生明显的抑菌圈，而在对照试验中，没有出现明显的抑菌圈，说明试验结果可以作为丑橘皮精油抑菌性能试验的理论依据。其中：霉菌的抑菌圈最小，说明丑橘皮精油对于霉菌的抑菌效果最弱；枯草芽胞杆菌的抑菌圈最大，说明抑制枯草芽胞杆菌对丑橘皮精油高度敏感，而对酵母菌抑制能力一般。

表4 丑橘精油抑菌性测定结果

3 结论与讨论

试验首先通过3种提取剂对比，确定石油醚为丑橘皮精油的最佳提取溶剂；根据单因素试验结果，采用相响应曲面法优化分析，并结合实际操作得到丑橘皮精油提取的最优工艺：浸提温度56 ℃、超声辅助提取时间61 min、料液比1∶6.1（g·mL-1）。此最优条件下丑橘皮精油得率最高可达到2.68%±0.09%。该方法成本低廉、操作简便、提取时间短，可为丑橘资源的综合开发利用提供理论参考。

提取所得丑橘皮精油对各类微生物均有不同程度的抑菌能力，其对枯草芽胞杆菌抑制能力最强，其次为酵母菌，而对霉菌的抑菌性一般。今后，可对丑橘皮精油进行纯化后进一步分析其抑菌成分，探究其抑菌机理。这不仅可以提高丑橘的利用价值，还将为食品贮藏保鲜、化妆品开发、天然清新剂研制等领域提供新的应用思路，发展前景广阔。