响应面优化大孔树脂纯化太行菊总黄酮及其降糖活性

葛水莲，陈建中, *，刘娜 ，杨明建，侯腾飞

1. 邯郸学院生命科学与工程学院（邯郸 056005）；2. 衡水学院化工学院（衡水 053000）；3. 韩国又石大学制药化妆品工程系（完州 55338）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）已成为一个全球性的公共健康问题。2017年国际糖尿病联盟公布了第八版的全球糖尿病地图，数据显示全球糖尿病患者（20～79岁）超过4.25亿，其中我国的糖尿病患者数量居全球第一位，高达1.14亿[1-3]。DM危害极大，但至今缺乏安全性和依从性高且长效的治疗方法[4-5]。近年来国内外学者高度关注安全有效的降糖物质天然黄酮，但不同来源的天然黄酮其成分与功效截然不同[6]。太行菊（Opisthopappus taihangensis）为中国特有珍稀物种，丛生于海拔1 000 m的峭壁之上，多抗旱且耐寒，主要分布于河南、山西、河北三省太行山南麓。太行菊全株通体富含芳香油，干后香味持久，经水蒸的太行菊花阴干后具有清肝明目和清热润喉的功效，作为药食两用的野生资源植物具有较高开发价值。现阶段太行菊的研究普遍停留在提取工艺[7]和种质资源应用方面[8-9]，而对太行菊黄酮（以下简称FOT）的降糖活性研究较少。此次试验分析FOT的最佳树脂纯化条件，探究FOT的降血糖作用机制，旨为新型天然抗糖尿病药物和保健食品的研发提供的药理学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试太行菊源自河北涉县偏城镇和合漳乡的河北地区野生种长裂太行菊。于开花前采集地上部分，采时株高4～10 cm。太行菊全株洗净尘土，鼓风干燥箱中60 ℃烘干至恒质量，粉碎过60目筛后备用。芦丁标准品，大孔吸附树脂（AB-8、D-101、DA-201、DM-301），试剂和药品分析纯。

1.2 太行菊总黄酮标准曲线绘制

黄酮浓度测定：吸取1 mL供试样液，用70%乙醇定容至5 mL，加0.3 mL 5%的NaNO2，摇匀后静置10 min；加0.3 mL 10%的A1(NO3)3，摇匀后静置10 min；加4 mL 4%的NaOH，最后10 mL容量瓶定容，摇匀静置20 min，测定试样吸光度[10]。

1.3 大孔树脂性能测定

称取1 g已预处理的4种AB-8型、D-101型、DA-201型、DM-301型大孔树脂，分别置于250 mL三角瓶中，分别加入3.97 mg/mL的总黄酮提取液，各100 mL，放置于恒温振荡箱中（25 ℃，60 r/min）静态吸附24 h。称取0.1 mL样液，测定其吸光度，计算相应的黄酮浓度[11]。按公式计算静态吸附量[12]。

式中：Q为静态吸附量，mg/g；C0为初始浓度，mg/mL；CV为剩余质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；W为树脂质量，g。

将吸附饱和的树脂用布氏漏斗进行分离，用去离子水冲洗并抽滤，然后置于250 mL三角瓶中，加入80 mL 90%乙醇溶液。放置于恒温振荡箱中（25 ℃，60 r/min）静态洗脱24 h。然后将树脂抽滤出，称移0.1 mL剩余液体测吸光度，计算黄酮浓度，按公式计算解吸率[13-14]。

式中：Z为解吸率，%；C为解吸液质量浓度，mg/mL；V为解吸液体积，mL；Q为静态吸附量，mg/g；M为树脂质量，g[14]。

1.4 太行菊黄酮对糖尿病小鼠血糖干预模型的建立

选取健康ICR小鼠，适应性饲养1周后禁食不禁水12 h，称质量后，随机抽取10只作空白对照组[15]。处理组小鼠按150 mg/kg剂量尾静脉注射新配制的四氧嘧啶生理盐水溶液（STZ），注射空白对照组小鼠等量缓冲液[16-17]。恢复饮食72 h后称质量，禁食不禁水12 h断尾采血。用葡萄糖试剂盒测定小鼠空腹血糖（FPG），凡FPG≥11.1 mmol/L视为糖尿病小鼠模型[18]。将糖尿病模型鼠依据血糖值的均衡原则分成5组：模型组、阳性对照组（盐酸二甲双胍）、太行菊黄酮高剂量组（200 mg/kg）、太行菊黄酮中剂量组（150 mg/kg）、太行菊黄酮低剂量组（100 mg/kg）。从第2天开始每天灌胃处理相应药物，而空白对照组和模型组均给与等量蒸馏水，阳性对照组按150 mg/kg灌胃盐酸二甲双胍，每周测3次空腹血糖值，连续给药4周[19]。研究期间保持小鼠饲养环境条件符合GB 14923—2010[20]，按动物试验3R原则予以小鼠人道关怀。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂静态吸附与解吸试验

试验所选择4种大孔树脂的筛选试验结果见表1。AB-8型树脂对太行菊总黄酮的吸附率和解吸率均较高。DM-301，DA-201和D-101的吸附率和解吸率均不高。所以选用AB-8型大孔树脂纯化太行菊总黄酮的粗提液。

表1 大孔吸附树脂静态吸附性能

2.2 响应面试验设计

2.2.1 因素的选取及方案

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，固定乙醇体积分数95%，每次装柱10 mL树脂进行试验。三因素选取：2，2.5和3 mg/mL上样液浓度（A）；1，2和3 mL/min上样液流速（B）；1，2和3 mL/min乙醇流速（C）。设计三因素三水平的响应面分析试验方案，以太行菊总黄酮回收率为响应值（R），进行响应面分析试验。采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计分析，试验方案及结果见表2。

2.2.2 三因素响应面模型建立与显著性检验

三因素对FOT回收率的影响不是简单的线性关系。为明确各因素对响应值的影响，采用Design-Expert 8.0.6对试验结果进行响应面二次回归拟合：黄酮回收率R=76.66+4.26A-4.10B-1.97C-1.92AB-0.25AC-0.34BC-0.49A2-8.04B2-2.54C2。方程中各项系数绝对值的大小反映了各因素对响应值的影响强弱，系数的正负反映了影响的方向。影响FOT回收率的主次顺序为：上样液浓度＞上样液流速＞乙醇流速。回归模型及系数显著性检验结果见表3，回归模型极显著（p=0.000 6＜0.01），失拟项不显著（p=0.330 6＞0.05），表明回归方程对试验拟合度较高，误差对试验结果影响很小。试验得到的模型拟合程度良好，试验误差小，可用该回归方程拟合试验真实点进行分析和预测FOT回收率。在总的作用因素中，A的一次项、B的一次项和二次项对响应值R影响达到极显著水平（p＜0.01），C的一次项和二次项对R影响达到显著水平（p＜0.05），表明这两个因素对太行菊总黄酮回收率的线性效应显著。而方程的AB、AC、BC的交互项和上样液浓度的二次项对R影响均未达到显著水平（p＞0.05）。

表2 响应面试验方案及试验结果

表3 响应面试验方差分析

2.2.3 AB-8树脂纯化太行菊黄酮的三因素间的交互作用

结合Box-Behnken试验设计方案，研究不同因素之间对总黄酮回收率的影响。根据回归方程得出不同因素的响应面分析图及相应等高线图，见图1～图3。从响应面分析图上可较直观地看出各因素交互作用对响应值的影响。若相应曲面陡峭则交互作用显著，等高线的密度越大，则条件的变化对响应值的影响越显著。等高线为椭圆形表示交互作用影响显著，为圆形则不显著[21]。图1中沿A轴向等高线相对密集，表现为曲线陡峭，说明上样液浓度对总黄酮回收率影响显著；沿B轴向等高线相对稀疏，表现为曲线较平滑，说明上样液流速对总黄酮回收率影响不显著。由等高线图为椭圆形可知，上样液浓度与上样液流速的交互作用极为显著。同理图2中上样液浓度对总黄酮回收率影响显著；乙醇流速对总黄酮回收率影响不显著。上样液浓度和乙醇流速的交互作用极为显著，表现为等高线密集。图3中B和C两个因素向等高线相对稀疏，表现为曲线较平滑。由等高线图为圆形可知，上样液浓度与乙醇流速的交互作用不显著。

图1 上样液浓度和上样液流速交互对黄酮回收率的响应面图

图2 上样液浓度和乙醇流速交互对黄酮回收率的响应面图

图3 上样液流速和乙醇流速交互对黄酮回收率的响应面图

2.2.4 AB-8树脂纯化太行菊黄酮提取工艺条件的确定

为了确定最佳点的值，对模型进行分析，以得到最高总黄酮回收率的最佳纯化工艺条件，经分析得出最佳纯化条件，结果见表4。最佳的分离纯化工艺条件为上样液质量浓度2.9 mg/mL、上样液流速1.6 mL/min、乙醇流速1.4 mL/min。此条件下太行菊总黄酮回收率理论值达81.40%。

2.3 FOT对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

表5为FOT对糖尿病小鼠空腹血糖的影响。STZ注射建模后，与正常组比，模型组及其他各组小鼠空腹血糖显著上升，差异达到极显著水平（p＜0.01）；灌胃1周后，与模型组相比，FOT各剂量组及药物组血糖明显降低（p＜0.05）；与模型组对比，小鼠灌胃4周后，太行菊黄酮高、中、低剂量组及药物组空腹血糖持续下降并接近正常组。

表4 响应面模型提取工艺优化值

表5 太行菊总黄酮对T2DM小鼠血糖水平的影响（x±s） mmol/L

3 结论与讨论

利用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计，通过改变不同的过柱条件获得回收率，进而构建纯化条件的响应面，并运用响应面法分析得到太行菊总黄酮的最佳纯化条件。研究上样液浓度（A）、上样液流速（B）、乙醇流速（C）三因素对太行菊总黄酮回收率的影响，建立纯化工艺的二次多项式数学模型，分析了各因素对响应值的影响。结果表明，模型拟合度高，试验误差小，最佳的分离纯化工艺条件为上样液质量浓度2.9 mg/mL、上样液流速1.6 mL/min、乙醇流速1.4 mL/min。此条件下太行菊总黄酮回收率理论值达81.40%。

四氧嘧啶造模法是一种Ⅱ型糖尿病模型制备的经典方法，通过尾静脉注射后小鼠血糖在长时间处于较高水平。结果显示，造模小鼠与正常小鼠相比，血糖水平均显著上升，同时出现“三多一少”的症状，小鼠毛发粗糙、精神不振，试验结果可信度高。STZ注射建模后，FOT对糖尿病小鼠空腹血糖的影响，参比模型组对糖尿病小鼠具有显著降血糖作用，并呈现显著的剂量效应关系，表明FOT能通过提高机体抗氧化功能，抑制氧自由基，从而降低糖尿病的血糖水平。虽然这些研究还处于实验室阶段，但这也为太行菊的开发应用提供了药理学依据。但黄酮在生物体内代谢作用途径更为复杂，因此太行菊黄酮的降糖机制值得深入研究。