聚乙二醇/(NH4)2SO4双水相萃取香菇多糖中蛋白质

王莹，邢晓玲，李屿君，王思怡，仲菲

江苏农牧科技职业学院动物药学院（泰州 225300）

香菇又称为香菌、花菇、香蕈，是一种药食同源的中药材，用于治风破血、化痰理气、益味助食、能够预防佝偻病、抑制癌细胞的生长[1-3]。香菇的有效成分主要包括香菇多糖、香菇嘌呤、微量元素等[4]。香菇多糖是香菇的主要活性成分，具有降血糖、抗氧化，抗病毒等药理活性，能够调节免疫功能，刺激干扰素形成，在临床上具有较好的研究前景[5-9]。热水浸提法是香菇多糖的传统提取方法[10]，此方法不仅可提出多糖，其他可溶性成分如蛋白质也会被提取出来，而多糖的药效与其纯度关系较大，因此，提取纯度较高的香菇多糖具有重要的意义。有关香菇的开发利用多集中于子实体部分，香菇柄占香菇总质量的30%左右，其营养活性成分的含量丰富，但因香菇柄纤维化程度高，咀嚼性差，在加工过程中没有被充分利用，造成资源浪费。采用聚乙二醇（PEG）-(NH4)2SO4双水相体系将香菇柄水提液中的多糖与蛋白质进行分离，通过单因素和正交试验探索蛋白质的最佳萃取参数，为香菇多糖的开发和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇柄（河南省南阳市雷氏菇品购销有限公司，将香菇柄烘干，粉碎，过20目筛，备用）。

葡萄糖对照品、考马斯亮蓝、牛血清白蛋白（国药集团化学试剂有限公司）；其余试剂均为市售分析纯。

①苏轼《卜算子》(缺月挂疏桐)：双调44字，上阕4句2仄韵，下阕4句2仄韵。句式：5575。5575。

1.2 仪器与设备

梅特勒-托利多AL204电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；HH-1数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；JJ-1精密增力电动搅拌器（国华电器有限公司）；XMTD-8222电热恒温鼓风干燥箱（上海姚氏仪器设备厂）；SHZ-DⅢ循环水式真空泵（河南省予华仪器有限公司）；HK-02A多功能粉碎机（上海烨昌食品机械有限公司）；80-2台式电动离心机（金坛市杰瑞尔电器有限公司）。

1.3 方法

感恩节(Thanksgiving Day)是美国人民独创的一个古老节日，也是美国人合家欢聚的节日。初时感恩节没有固定日期，由美国各州临时决定。直到美国独立后的1863年，林肯总统宣布感恩节为全国性节日。1941年，美国国会正式将每年11月第四个星期四定为“感恩节”。感恩节放假一天，但很多地方会将假期延长到星期天。

称取35 g香菇柄粉放入圆底烧瓶中，加500 mL蒸馏水，于50 ℃水浴锅中搅拌提取约2 h，抽滤得到香菇柄水提液，放入冰箱4 ℃保存。

1.3.2 香菇柄水提液中蛋白质与多糖浓度的测定

“张梦华，如果你对30万元代孕费还不满意的话，我们也可以再加钱，你说多少钱都没问题。”陈清小心地说道。

1.3.2.1 蛋白质标准曲线的绘制

今天，我国的物流业多项指标已经排名在世界前列，论规模已经成为世界物流大国。据了解，中国的物流市场已经达到12万多亿元，这已经超出美国的9万多亿元，论市场规模已经成为世界第一。

1.3.1 香菇柄水提液的制备

参照相关文献[11]，以牛血清蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。以吸光度（y）对蛋白质浓度（x）回归，得回归方程为y=0.003 5x-0.005 2（R2=0.995 6），表明在40～200 μg/mL范围内蛋白质浓度与其吸光度呈良好的线性关系。

1.3.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制

参照相关文献[12]，以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸显色法测定多糖的浓度，以吸光度（y）对葡萄糖浓度（x）回归，得回归方程为y=0.014 2x-0.006 9（R2=0.996 5），表明在10.56～52.8 μg/mL范围内葡萄糖浓度与其吸光度呈良好的线性关系。

1.3.2.3 蛋白质的含量测定

精密移取1.00 mL香菇柄水提液于容量瓶中，按照1.3.2.1测算出蛋白质质量浓度179.49 μg/mL，后续试验均采用此浓度的香菇水提液。

1.3.3 蛋白质的萃取及含量测定

选用浓度18%的PEG 4000和17%(NH4)2SO4的双水相体系，分别加入0，1%，2%，3%和4%的NaCl，调至pH 6.0，在每个刻度离心管中分别加入5.00 mL香菇水提液，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心萃取30 min。

蛋白质的萃取率（E）按式（1）求得。

③水利设施水毁严重。洪水损坏堤防1 859km、护岸940处、水库300座、水电站50座，冲毁塘坝98座，损坏水闸649座，损坏灌溉设施7 179处，水利直接经济损失达54亿元。

由图3可知，随着PEG 4000浓度增大，Y变化不大，E先增大后减小，这是因为(NH4)2SO4浓度一定时，增大PEG 4000浓度，会使体系中成相物质的总浓度增加，萃取相的极性减小，而蛋白质是具有部分极性的非极性物质，故其在萃取相中的溶解度随之增加，从而使E不断增加[14]。PEG 4000浓度太高，可能会使萃取相中的极性降低太多，从而使(NH4)2SO4的溶解度降低而增加体系黏度，阻止相间分子的转移，使蛋白质滞留在两相之间，导致E减小。因此，PEG 4000的最佳浓度为18%。

式中：ct1和cb1分别为萃取完全后蛋白质在上相（PEG相）和下相（硫酸铵相）中的质量浓度，μg/mL；Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积 ，mL。

亲水性聚合物PEG和硫酸铵在水中形成两相的原因是由于聚合物的不相容性或盐析，只有当这两种物质在水相中达到一定浓度时，才能形成两相[13]。图1显示，由不同分子量的PEG和(NH4)2SO4组成的两相系统。PEG的平均分子量越大，双结线越接近原点，相临界浓度越低。

式中：ct2和cb2分别为萃取完全后多糖在上相（PEG相）和下相（硫酸铵相）中的质量浓度，μg/mL；Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积，mL。

对流动相的流速和柱温进行了优化选择。选择0.8，1.0，1.2 mL/min这3种不同的流速来考察10种酚类物质的分离效果。实验表明，流速为0.8 mL/min时，1-萘酚的保留时间为25.80 min，保留时间较长；流速为1.2 mL/min时，香草醛与苯酚没有达到基线分离；1.0 mL/min时，1-萘酚的保留时间为24.275 min，香草醛与苯酚的分离度较大。综合考虑保留时间和分离效果，最终选择1.0 mL/min。

2 结果与分析

2.1 双水相体系相图

香菇多糖回收率（Y）按式（2）求得。

图1 PEG/(NH4)2SO4双水相图

2.2 单因素试验

2.2.2 PEG 4000浓度对蛋白质萃取率的影响

称取同等质量的PEG 1500、PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000、PEG 8000于5个刻度离心管中，固定PEG浓度18%，(NH4)2SO4浓度17%，调pH 6.0，在每个刻度离心管中分别加入5.00 mL香菇水提液，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心萃取30 min。

由图2可知，随着PEG分子量增大，E和Y均先增大后减少。即在PEG 4000的双水相系统中，多糖回收率Y和蛋白质萃取率E达到最高，故试验选用分子量4 000的聚乙二醇。

图2 不同分子量PEG对蛋白质萃取率的影响

2.2.1 PEG的分子量对蛋白质萃取率的影响

以电动牙刷为例。电动牙刷的问世已经有一段时间了，对其的评价也是褒贬不一，笔者也是用了好几年的点用牙刷了，首先先谈一谈它的好处。曾经医学上推出了巴氏刷牙法，能真正的对牙齿进行清洁，但其实很难做到，而电动牙刷可以达到比巴氏刷牙法更好的效果，几乎大部分人都因清洁度不够而有牙结石；其次，有相当一部分人患有牙龈出血、牙周炎等疾病，牙龈出血实质是牙结石、牙菌斑在刺激牙龈，引发牙龈发炎、红肿出血，电动牙刷能比手刷更多清除牙菌斑，预防此类口腔疾病。

固定(NH4)2SO4浓度为17%，调节PEG 4000浓度分别为14%，16%，18%，20%和22%，调pH 6.0，在每个刻度离心管中分别加入5.00 mL香菇水提液，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心萃取30 min。

在距离较长的贯通隧道上方钻孔，对埋深度较低的隧道进行传统坐标的双导线布设，使用全站仪、垂准仪等安置在地铁中，其具体技术操作流程为，使用双头点、双定向的方法，可以提高测量的精准度，获得准确的定向测量的坐标，或者使用导线，定向地铁测量方法，保持仪器设备的定向安置以及合理组合，适用于场地较为狭小的地铁施工路段。在多种施工环境的地铁施工环境下，这是一种定向测量方法，应有一个起算控制点作为中线控制点，通过原有施工中线控制点进行联络线结网等的铺设，可以保持测量精度的优势。

图3 PEG 4000浓度对蛋白质萃取率的影响

2.2.3 (NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响

固定PEG 4000浓度18%，调节(NH4)2SO4浓度分别为13%，15%，17%，19%和21%，调至pH 6.0，在每个刻度离心管中分别加入5.00 mL香菇水提液，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心萃取30 min。

由图4可知，随着(NH4)2SO4浓度增加，多糖回收率Y始终维持在较高水平，E先增大后减少。这是因为(NH4)2SO4浓度越大，无机盐的盐析作用越强，蛋白质在PEG 4000里的浓度越高，E增大，但(NH4)2SO4浓度过大时，无机盐影响蛋白质表面疏水性，反而使E减少[15]。因此，(NH4)2SO4最佳浓度为17%。

学校对学生的德育教育离不开思想品德课。所以更应该加强师资队伍的建设，加强对思想品德课的重视。德育教育的发展才走出了一小步，未来的辉煌需要我们共同筑造。在信息技术高速发展的今天，德育教育的方式还需要不断探索，做好学生的思想道德建设，不仅需要学校的努力，还需要家庭的配合以及国家的大力支持。只有在各方的共同努力之下，学生的素质教育才能得到质的飞跃，德育教育才能取得累累硕果。

图4 (NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响

2.2.4 NaCl浓度对蛋白质萃取率的影响

称取一定质量的PEG于刻度离心管中，固定PEG和(NH4)2SO4的浓度，调节pH，加入5.00 mL香菇水提液，离心机的转速固定为2 000 r/min。待两相完全分离后，分别读取上相和下相的体积，用苯酚-硫酸显色法和考马斯亮蓝法分别测定上、下两相中多糖和蛋白质的浓度。平行3次取样，得吸光度平均值。

由图5可知，随着NaCl浓度增加，Y变化不大，E先增大后减少，这是因为在萃取体系中加入NaCl，可以促进蛋白质的溶解，E上升，但是加入过多的NaCl，会促使萃取相的极性增强，蛋白质溶解度下降，E下降[16]，因此，NaCl最佳浓度为1%。

图5 NaCl浓度对蛋白质萃取率的影响

2.2.5 pH对蛋白质萃取率的影响

选用浓度18%的PEG 4000和17%硫酸铵的双水相体系，调节pH 5.5，6.0，6.5，7.0和7.5，在每个分液漏斗中分别加入5.00 mL香菇水提液，摇匀，离心机转速设为2 000 r/min，离心萃取30 min。

由于反季节农产品价值高，大大刺激了农户对好肥料的需求，在这里最常听到的一句话就是“只要肥料好，价钱多少都无所谓”。因此，几百块钱一包（袋）的进口肥在当地非常畅销。为让广大农户用到性价比更高的国产肥料，9月底第一批反季节瓜菜进入栽种期时，新洋丰决定在东方市八所镇小岭村用洋丰百倍邦套餐施肥以茄子为示范作物挑战在当地很畅销的进口肥料。

Sarangi等[17]发现体系的pH与蛋白质的等电点相差越大，蛋白质在两相中分配越不均匀，pH的微小变化可能会使蛋白质分子的分配系数改变较大，由图6可知，随着pH增加，Y变化不大，E先增大后减少。因此，最佳pH为6.5。

2.3 正交试验与结果分析

2.3.1 正交试验

图6 pH对蛋白质萃取率的影响

表1 正交试验因素与水平设计

表2 正交试验结果

在单因素试验基础上，以PEG 4000浓度（A）、硫酸铵的浓度（B）、氯化钠浓度（C）及pH（D）为因素，采用L9(34)正交进行试验，正交设计见表1，所得结果见表2。以蛋白质萃取率为指标，优化萃取最佳工艺参数。由极差R分析可知，4个因素对蛋白质萃取率影响的主次顺序为(NH4)2SO4浓度（B）＞pH（D）＞PEG 4000浓度（A）＞NaCl浓度（C）。结合均值K分析得最佳工艺条件为A2B2C2D2，即PEG 4000浓度18%、(NH4)2SO4浓度17%、NaCl浓度1%、pH 6.5。

2.3.2 验证试验结果

表3 验证试验结果

由表3验证试验结果可知，按照正交试验确定的优化条件进行提取，蛋白质萃取率平均达81.57%，高于表2中所有试验组合的蛋白质萃取率。

何良诸明白，站得太近，铁锹削下别人的脑袋，当煤块扔进车里，就坏菜了。谁都看不见谁，脑袋没了，身体站着，手里举着锹，别人寻思你还在于活呢。在死黑里，容易引起残暴的联想。三个人分开，从矿车两侧和车尾，三个不同的方向，将煤一锹锹扔进车内，噗通、噗通声，分外沉闷。扔了几十锹后，年轻人直起身，喘。何良诸也喘起来，干体力活不行了。年轻人说：“难怪说矿工吃的是阳世饭，干的是阴间活。”

3 结论与讨论

试验采用PEG 4000/(NH4)2SO4双水相体系对香菇柄水提液中的多糖与蛋白质进行分离萃取，通过单因素试验和正交试验，得出蛋白质最佳萃取参数为：香菇柄水提液5.00 mL，PEG 4000浓度18%，硫酸铵浓度17%，NaCl浓度1%，pH 6.5，蛋白质萃取率为81.57%。

多糖脱蛋白质的方法除了双水相萃取以外，还有Sevag法和三氯乙酸法。Sevag法是分离多糖中蛋白质的常见方法，该法采用氯仿与戊醇或正丁醇的混合液反复处理多糖，效果较好，但消耗大量有机试剂，导致多糖产品成本上升，同时水相和有机相多次混合、分离，对多糖的产率有一定影响[18]。三氯乙酸法脱蛋白质的效率较高，但需在低温情况下进行，且三氯乙酸具有较强的酸性，容易引起多糖糖苷键断裂[19]。而双水相体系萃取法简单方便，萃取温度接近室温，不会引起蛋白质失活或变性，化学试剂使用少，几乎无污染，是一种绿色的萃取方法。