白青云,赵立,刘明亚
淮阴工学院生命科学与食品工程学院(淮安 223003)
南瓜作为一种常见的食材,营养价值高,富含多种氨基酸、维生素、矿物质、多糖及蛋白质等,具有预防糖尿病、动脉硬化、溶解结石、催化分解致癌物质等作用,且价格低廉,已然成为食品界的新宠[1]。
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)是生物体内广泛存在的一种非蛋白质氨基酸,由谷氨酸(Glu)经谷氨酸脱羧酶(GAD EC 4.1.1.15)脱羧产生,是哺乳动物大脑中重要的抑制性神经递质,具有降血压、利尿、镇静神经、改善失眠以及肾肝功能活化等作用[2]。植物组织中GABA含量很低,不能满足人体需要,因此,提高GABA含量的方法成为研究热点。报道称,植物受到低氧、冷激、热激、干旱、盐胁迫和机械伤害等逆境胁迫时体内GABA含量明显升高[3]。目前,关于食物富集GABA的方法屡见报道,如茶叶采用厌氧处理富集GABA[4]、麦胚采用水浴保温富集GABA[5]、马铃薯采用浸渍法富集GABA[6]等。
目前,南瓜主要作为蔬菜烹饪食用,加工品主要有南瓜粉、南瓜酱、南瓜果脯蜜饯、南瓜饮料等低层次的加工应用,而对于南瓜中的活性物质没有充分的开发和利用。张华等[7]测定南瓜中Glu含量丰富,并含有一定量的GABA。鲜切南瓜因新鲜方便和健康卫生等特点受到消费者青睐,需求量日益增长。试验选用种植面广、粮蔬兼用的南瓜为原料,采用浸渍方法研究鲜切南瓜富集GABA的关键技术,优化技术参数,为开发富含GABA的南瓜食品提供理论参考。
生鲜南瓜,市售新鲜原料,品种为锦红一号,购买后贮藏于0~4 ℃密封环境中,备用;GABA标品,购自美国Sigma化学品公司;谷氨酸钠(MSG)、维生素B6(VB6)、CaCl2,购于食品添加剂公司,均为食品级;其他试剂,购自国药化学试剂有限公司,均为分析纯。
TDL-40B型离心机,上海安亭仪器厂;HH-6型数显恒温水浴锅,常州国华电器有限公司;V-1000型可见分光光度计,上海翔艺仪器有限公司;DHP-9162型电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;101-1BS型电热恒温鼓风干燥箱,上海跃进医疗器械厂;FK-A组织捣碎匀浆机,江苏省金坛市环宇科学仪器厂。
1.2.1 材料处理
将挑选好的南瓜洗净后用1%次氯酸钠溶液浸泡消毒30 min,然后去皮去瓤,切成块状,放入烧杯,加入浸渍液,要使得烧杯内溶液完全浸没鲜切南瓜,用保鲜膜封好烧杯口置于恒温培养箱中于一定温度下放置一定时间,浸渍结束后取出样品,测定其GABA含量。
1.2.2 浸渍工艺对鲜切南瓜富集GABA的影响
对影响南瓜富集GABA的浸渍工艺,先进行单因素试验,设定浸渍温度为20~50 ℃,浸渍时间为2~8 h,浸渍液pH为4.6~6.4(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液),在单因素试验的基础上,采用正交试验设计原理的三因素三水平试验设计,优化鲜切南瓜富集GABA的最适浸渍工艺。
1.2.3 浸渍液组分对鲜切南瓜富集GABA的影响
为进一步提高鲜切南瓜中GABA含量,在最适工艺的基础上,对影响GABA富集的浸渍液添加物MSG、VB6和CaCl2的最适浓度进行研究。分别配制不同浓度的各组分溶液,所有溶液均由10 mmol/L的柠檬酸缓冲液配制而成,调节初始pH至5.8,MSG质量浓度设为6~18 mg/mL;VB6浓度设为0.1~0.4 mmol/mL;CaCl2浓度设为1.0~4.0 mmol/L。对影响鲜切南瓜GABA富集的浸渍液组分采用Box-Behnken Design试验设计进行优化,以GABA含量作为考察值。
将富集GABA后的鲜切南瓜样品用组织捣碎机磨碎后,精确称取1 g左右样品于20 mL离心管中,加入6 mL 7%的乙酸提取1 h后以4 000 r/min离心10 min,上清液中再加入4 mL无水乙醇沉淀30 min,以4 000 r/min离心10 min后,上清液经旋转蒸发浓缩至干,用1 mL蒸馏水溶解后以10 000 r/min离心10 min,上清液用于测定GABA含量。GABA含量测定参照白青云等[8]的方法,采用比色法测定。
试验均重复3次,结果以x±SD表示,试验设计软件采用设计专家Design Expert 7.0软件,采用SPSS 16.0软件处理试验数据,进行方差分析和显著性检验。
2.1.1 温度对鲜切南瓜富集GABA的影响
由图1可见,在20~50 ℃范围内,鲜切南瓜处理6 h的条件下(培养液pH 5.8),温度对鲜切南瓜GABA含量有显著影响,呈先上升后下降的趋势,40 ℃时GABA含量最高(0.213 mg/g),分别为20和50 ℃的2.55倍和1.08倍。温度过高或过低会导致酶活性降低,从而导致Glu无法转化成GABA或者转化率低。马铃薯浸渍富集GABA的最适温度为35 ℃[6],鲜切胡萝卜中GABA含量也会随着贮藏温度的升高而增加[9]。研究中,鲜切南瓜提高GABA含量的适宜浸渍温度定为40 ℃。
图1 温度对鲜切南瓜中GABA含量的影响
2.1.2 浸渍时间对鲜切南瓜GABA含量的影响
在温度30 ℃、培养液pH 5.8的条件下,鲜切南瓜中GABA含量随浸渍时间的延长而变化的情况见图2。从图2可以看出,随着浸渍时间的延长,鲜切南瓜中GABA含量呈先缓慢增加而后急剧增加又降低的趋势,浸渍6 h含量最高,是浸渍2 h的3.41倍;浸渍4 h与8 h鲜切南瓜中GABA含量无显著差异(p<0.05)。因此,选择浸渍6 h为鲜切南瓜富集GABA的适宜时间。
图2 时间对鲜切南瓜中GABA含量的影响
2.1.3 浸渍液pH对鲜切南瓜中GABA含量的影响
在浸渍温度30 ℃、浸渍时间6 h的条件下,浸渍液pH对鲜切南瓜中GABA富集的影响结果见图3。pH在4.6~6.4之间,GABA含量随pH的升高先升高后下降。当pH为5.8时,GABA含量最高(0.207 mg/g),分别比pH4.6和6.4时含量提高63.81%和22.66%。酸性环境下有利于植物GABA的富集[10],不同原料GAD最适pH不同。研究表明,南瓜GAD的最适pH为5.8,在该pH下酶活力最高,同时酶活力随pH的升高呈先增后降的趋势[11]。试验得出的结论与此研究结果一致。因此,鲜切南瓜富集GABA的适宜pH定为5.8。
2.1.4 正交试验法优化鲜切南瓜富集GABA的培养条件
在单因素试验的基础上,以浸渍时间(A)、浸渍温度(B)和浸渍液pH(C)三因素进行正交试验,优化鲜切南瓜富集GABA的最适培养工艺,试验结果见表1。
表1的正交试验数据表明,鲜切南瓜富集GABA的最适浸渍条件为A1B2C2,即浸渍时间4 h、浸渍温度40℃、浸渍液pH 5.8。极差分析可知,浸渍温度是最主要的影响因素,浸渍时间次之,最后是浸渍液pH。在最适浸渍工艺下,鲜切南瓜中GABA含量为0.291 mg/g,是原料的5.43倍(南瓜原料中GABA含量测定为0.053 6 mg/g)。
2.2.1 MSG对鲜切南瓜GABA含量的影响
由图4可知,随着浸渍液中MSG浓度的增加,鲜切南瓜中GABA含量呈先增长后下降的趋势。当MSG质量浓度为14 mg/mL时,GABA含量最高(0.484 mg/g),是添加6 mg/mL MSG的1.81倍。植物GAD的直接底物是Glu,MSG是其钠盐,可以提供Glu,作为植物GAD的底物,促进GABA的合成[10]。马铃薯浸渍中添加MSG可以促进GABA的富集[6],研究结果与其一致。底物也不能过多,否则会起反馈抑制作用。Bai等[12]研究得出,过多的Glu会降低GAD活性,从而抑制GABA积累。
图4 MSG质量浓度对鲜切南瓜GABA含量的影响
2.2.2 CaCl2对鲜切南瓜GABA含量的影响
CaCl2对鲜切南瓜中GABA富集的影响见图5。随着CaCl2浓度的增加,鲜切南瓜中GABA含量呈先增长后下降的变化趋势。当CaCl2浓度为3.0 mmol/L时,GABA富集量最大,比添加1 mmol/L CaCl2提高34.28%。植物GAD受Ca2+的调节,增加Ca2+会刺激GAD活性,促进GABA的积累[13]。低氧胁迫下发芽粟谷中GABA含量由于Ca2+浓度的增加显著提高[12]。
图5 CaCl2浓度对鲜切南瓜GABA含量的影响
2.2.3 VB6对鲜切南瓜中GABA含量的影响
浸渍液中添加VB6提高了鲜切南瓜中GABA的含量(图6)。GABA含量随VB6添加量的增加而提高,当VB6为0.3 mmol/mL时,GABA含量最高,但添加0.4 mmol/mL VB6无显著差异。研究表明,VB6是GAD的辅基磷酸吡哆醛(PLP)的前体物质,在磷酸缓冲液中可转化为PLP,激活GAD达到富集GABA的作用[14]。适量添加VB6促进GABA积累。试验中,鲜切南瓜富集GABA的适宜VB6添加量为0.3 mmol/mL。
图6 VB6浓度对鲜切南瓜GABA含量的影响
2.2.4 鲜切南瓜富集GABA的浸渍液组分优化
在单因素试验的基础上,选用三因素三水平的Box-Behnken试验设计对鲜切南瓜富集GABA的浸渍液组分CaCl2浓度(X1)、MSG浓度(X2)和VB6浓度(X3)进行优化,试验方案和相应的试验结果见表2。
利用Design Expert 7.0软件,对表2数据进行二次多元逐步回归拟合,得到鲜切南瓜富集GABA预测值的二次多项逐步回归方程:
表2 鲜切南瓜富集GABA的浸渍液组分Box-Behnken试验设计和结果
对回归模型进行方差分析(表3),结果表明,回归模型的F=35.00,p<0.000 1,模型显著,其决定系数R2=0.978 3,说明此模型相关性良好,模型具有实践指导意义。
表3 回归模型方差分析
根据回归法分析所得二次方程,在试验设定范围内,得到对响应值有显著交互作用影响的两因素的响应曲面图,见图7。
当VB6浓度为0.3 mmol/mL时,MSG和CaCl2对鲜切南瓜中GABA富集的交互作用影响见图7。MSG和CaCl2的一次项和二次项分别对鲜切南瓜GABA含量有极显著的影响(p<0.01),两者的交互作用也影响显著(p=0.000 9)(表3)。在固定的MSG浓度下,GABA含量随CaCl2浓度的增加呈先快速增加随后下降的趋势。当CaCl2浓度为3.35 mmol/L时,GABA富集量最大。当MSG质量浓度为10.24 mg/mL,GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物,添加适量的MSG可以促进GABA合成,形成有效积累[10]。Ca2+是GAD的激活剂,通过与GAD碳末端的Ca2+/CaM调节区域结合而激活其活性[13],促进GABA富集。低氧通气下,MSG与CaCl2的联合处理可显著促进GABA含量的提高[8],研究结果与此报道结果一致。
图7 MSG和CaCl2的交互作用对鲜切南瓜GABA含量影响的响应曲面图
根据Box-Behnken试验结果,鲜切南瓜富集GABA的最佳培养液组分浓度分别为CaCl2浓度3.35 mmol/L、MSG质量浓度10.24 mg/mL和VB6浓度0.37 mmol/mL,在此条件下鲜切南瓜富集GABA的预测值为0.546 mg/g,验证试验得出实测值为0.569 mg/g,说明预测值和实际值之间存在较高的拟合度,所建立的模型是可靠的,可以用来描述组分浓度与响应值之间的关系。以最适浸渍液浓度培养的鲜切南瓜GABA含量是是原料中的10.62倍,说明优化后的浸渍液组分能显著提高鲜切南瓜中GABA含量。
首先研究了鲜切南瓜富集GABA的工艺,正交试验结果表明,浸渍液pH、浸渍温度和浸渍时间对鲜切南瓜GABA富集有显著影响,三因素的影响顺序依次为浸渍温度>浸渍时间>浸渍液pH,最佳的浸渍工艺为浸渍时间4 h,浸渍温度40 ℃,浸渍液pH 5.8,此时鲜切南瓜中GABA的富集量为0.291 mg/g,是原料的5.43倍。接着研究了浸渍液组分对鲜切南瓜富集GABA的影响,响应面的Box-Behnken试验结果表明,鲜切南瓜富集GABA的最佳浸渍液组分浓度为CaCl23.35 mmol/L、MSG 10.24 mg/mL和VB6浓度0.37 mmol/mL,在此条件下鲜切南瓜中GABA含量为0.569 mg/g,是原料的10.62倍。方差分析可知,CaCl2、MSG、VB6对鲜切南瓜中GABA的富集均有显著影响,MSG和CaCl2的交互作用对鲜切南瓜中GABA富集有显著影响。