浸渍处理鲜切南瓜富集γ-氨基丁酸的工艺优化

白青云，赵立，刘明亚

淮阴工学院生命科学与食品工程学院（淮安 223003）

南瓜作为一种常见的食材，营养价值高，富含多种氨基酸、维生素、矿物质、多糖及蛋白质等，具有预防糖尿病、动脉硬化、溶解结石、催化分解致癌物质等作用，且价格低廉，已然成为食品界的新宠[1]。

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是生物体内广泛存在的一种非蛋白质氨基酸，由谷氨酸（Glu）经谷氨酸脱羧酶（GAD EC 4.1.1.15）脱羧产生，是哺乳动物大脑中重要的抑制性神经递质，具有降血压、利尿、镇静神经、改善失眠以及肾肝功能活化等作用[2]。植物组织中GABA含量很低，不能满足人体需要，因此，提高GABA含量的方法成为研究热点。报道称，植物受到低氧、冷激、热激、干旱、盐胁迫和机械伤害等逆境胁迫时体内GABA含量明显升高[3]。目前，关于食物富集GABA的方法屡见报道，如茶叶采用厌氧处理富集GABA[4]、麦胚采用水浴保温富集GABA[5]、马铃薯采用浸渍法富集GABA[6]等。

目前，南瓜主要作为蔬菜烹饪食用，加工品主要有南瓜粉、南瓜酱、南瓜果脯蜜饯、南瓜饮料等低层次的加工应用，而对于南瓜中的活性物质没有充分的开发和利用。张华等[7]测定南瓜中Glu含量丰富，并含有一定量的GABA。鲜切南瓜因新鲜方便和健康卫生等特点受到消费者青睐，需求量日益增长。试验选用种植面广、粮蔬兼用的南瓜为原料，采用浸渍方法研究鲜切南瓜富集GABA的关键技术，优化技术参数，为开发富含GABA的南瓜食品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、设备与仪器

生鲜南瓜，市售新鲜原料，品种为锦红一号，购买后贮藏于0～4 ℃密封环境中，备用；GABA标品，购自美国Sigma化学品公司；谷氨酸钠（MSG）、维生素B6（VB6）、CaCl2，购于食品添加剂公司，均为食品级；其他试剂，购自国药化学试剂有限公司，均为分析纯。

TDL-40B型离心机，上海安亭仪器厂；HH-6型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；V-1000型可见分光光度计，上海翔艺仪器有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；101-1BS型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；FK-A组织捣碎匀浆机，江苏省金坛市环宇科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理

将挑选好的南瓜洗净后用1%次氯酸钠溶液浸泡消毒30 min，然后去皮去瓤，切成块状，放入烧杯，加入浸渍液，要使得烧杯内溶液完全浸没鲜切南瓜，用保鲜膜封好烧杯口置于恒温培养箱中于一定温度下放置一定时间，浸渍结束后取出样品，测定其GABA含量。

1.2.2 浸渍工艺对鲜切南瓜富集GABA的影响

对影响南瓜富集GABA的浸渍工艺，先进行单因素试验，设定浸渍温度为20～50 ℃，浸渍时间为2～8 h，浸渍液pH为4.6～6.4（柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液），在单因素试验的基础上，采用正交试验设计原理的三因素三水平试验设计，优化鲜切南瓜富集GABA的最适浸渍工艺。

1.2.3 浸渍液组分对鲜切南瓜富集GABA的影响

为进一步提高鲜切南瓜中GABA含量，在最适工艺的基础上，对影响GABA富集的浸渍液添加物MSG、VB6和CaCl2的最适浓度进行研究。分别配制不同浓度的各组分溶液，所有溶液均由10 mmol/L的柠檬酸缓冲液配制而成，调节初始pH至5.8，MSG质量浓度设为6～18 mg/mL；VB6浓度设为0.1～0.4 mmol/mL；CaCl2浓度设为1.0～4.0 mmol/L。对影响鲜切南瓜GABA富集的浸渍液组分采用Box-Behnken Design试验设计进行优化，以GABA含量作为考察值。

1.3 GABA测定方法

将富集GABA后的鲜切南瓜样品用组织捣碎机磨碎后，精确称取1 g左右样品于20 mL离心管中，加入6 mL 7%的乙酸提取1 h后以4 000 r/min离心10 min，上清液中再加入4 mL无水乙醇沉淀30 min，以4 000 r/min离心10 min后，上清液经旋转蒸发浓缩至干，用1 mL蒸馏水溶解后以10 000 r/min离心10 min，上清液用于测定GABA含量。GABA含量测定参照白青云等[8]的方法，采用比色法测定。

1.4 数据统计与分析

试验均重复3次，结果以x±SD表示，试验设计软件采用设计专家Design Expert 7.0软件，采用SPSS 16.0软件处理试验数据，进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 浸渍工艺对鲜切南瓜中GABA含量的影响

2.1.1 温度对鲜切南瓜富集GABA的影响

由图1可见，在20～50 ℃范围内，鲜切南瓜处理6 h的条件下（培养液pH 5.8），温度对鲜切南瓜GABA含量有显著影响，呈先上升后下降的趋势，40 ℃时GABA含量最高（0.213 mg/g），分别为20和50 ℃的2.55倍和1.08倍。温度过高或过低会导致酶活性降低，从而导致Glu无法转化成GABA或者转化率低。马铃薯浸渍富集GABA的最适温度为35 ℃[6]，鲜切胡萝卜中GABA含量也会随着贮藏温度的升高而增加[9]。研究中，鲜切南瓜提高GABA含量的适宜浸渍温度定为40 ℃。

图1 温度对鲜切南瓜中GABA含量的影响

2.1.2 浸渍时间对鲜切南瓜GABA含量的影响

在温度30 ℃、培养液pH 5.8的条件下，鲜切南瓜中GABA含量随浸渍时间的延长而变化的情况见图2。从图2可以看出，随着浸渍时间的延长，鲜切南瓜中GABA含量呈先缓慢增加而后急剧增加又降低的趋势，浸渍6 h含量最高，是浸渍2 h的3.41倍；浸渍4 h与8 h鲜切南瓜中GABA含量无显著差异（p＜0.05）。因此，选择浸渍6 h为鲜切南瓜富集GABA的适宜时间。

图2 时间对鲜切南瓜中GABA含量的影响

2.1.3 浸渍液pH对鲜切南瓜中GABA含量的影响

在浸渍温度30 ℃、浸渍时间6 h的条件下，浸渍液pH对鲜切南瓜中GABA富集的影响结果见图3。pH在4.6～6.4之间，GABA含量随pH的升高先升高后下降。当pH为5.8时，GABA含量最高（0.207 mg/g），分别比pH4.6和6.4时含量提高63.81%和22.66%。酸性环境下有利于植物GABA的富集[10]，不同原料GAD最适pH不同。研究表明，南瓜GAD的最适pH为5.8，在该pH下酶活力最高，同时酶活力随pH的升高呈先增后降的趋势[11]。试验得出的结论与此研究结果一致。因此，鲜切南瓜富集GABA的适宜pH定为5.8。

2.1.4 正交试验法优化鲜切南瓜富集GABA的培养条件

在单因素试验的基础上，以浸渍时间（A）、浸渍温度（B）和浸渍液pH（C）三因素进行正交试验，优化鲜切南瓜富集GABA的最适培养工艺，试验结果见表1。

表1的正交试验数据表明，鲜切南瓜富集GABA的最适浸渍条件为A1B2C2，即浸渍时间4 h、浸渍温度40℃、浸渍液pH 5.8。极差分析可知，浸渍温度是最主要的影响因素，浸渍时间次之，最后是浸渍液pH。在最适浸渍工艺下，鲜切南瓜中GABA含量为0.291 mg/g，是原料的5.43倍（南瓜原料中GABA含量测定为0.053 6 mg/g）。

2.2 浸渍液组分对鲜切南瓜富集GABA的影响

2.2.1 MSG对鲜切南瓜GABA含量的影响

由图4可知，随着浸渍液中MSG浓度的增加，鲜切南瓜中GABA含量呈先增长后下降的趋势。当MSG质量浓度为14 mg/mL时，GABA含量最高（0.484 mg/g），是添加6 mg/mL MSG的1.81倍。植物GAD的直接底物是Glu，MSG是其钠盐，可以提供Glu，作为植物GAD的底物，促进GABA的合成[10]。马铃薯浸渍中添加MSG可以促进GABA的富集[6]，研究结果与其一致。底物也不能过多，否则会起反馈抑制作用。Bai等[12]研究得出，过多的Glu会降低GAD活性，从而抑制GABA积累。

图4 MSG质量浓度对鲜切南瓜GABA含量的影响

2.2.2 CaCl2对鲜切南瓜GABA含量的影响

CaCl2对鲜切南瓜中GABA富集的影响见图5。随着CaCl2浓度的增加，鲜切南瓜中GABA含量呈先增长后下降的变化趋势。当CaCl2浓度为3.0 mmol/L时，GABA富集量最大，比添加1 mmol/L CaCl2提高34.28%。植物GAD受Ca2+的调节，增加Ca2+会刺激GAD活性，促进GABA的积累[13]。低氧胁迫下发芽粟谷中GABA含量由于Ca2+浓度的增加显著提高[12]。

图5 CaCl2浓度对鲜切南瓜GABA含量的影响

2.2.3 VB6对鲜切南瓜中GABA含量的影响

浸渍液中添加VB6提高了鲜切南瓜中GABA的含量（图6）。GABA含量随VB6添加量的增加而提高，当VB6为0.3 mmol/mL时，GABA含量最高，但添加0.4 mmol/mL VB6无显著差异。研究表明，VB6是GAD的辅基磷酸吡哆醛（PLP）的前体物质，在磷酸缓冲液中可转化为PLP，激活GAD达到富集GABA的作用[14]。适量添加VB6促进GABA积累。试验中，鲜切南瓜富集GABA的适宜VB6添加量为0.3 mmol/mL。

图6 VB6浓度对鲜切南瓜GABA含量的影响

2.2.4 鲜切南瓜富集GABA的浸渍液组分优化

在单因素试验的基础上，选用三因素三水平的Box-Behnken试验设计对鲜切南瓜富集GABA的浸渍液组分CaCl2浓度（X1）、MSG浓度（X2）和VB6浓度（X3）进行优化，试验方案和相应的试验结果见表2。

利用Design Expert 7.0软件，对表2数据进行二次多元逐步回归拟合，得到鲜切南瓜富集GABA预测值的二次多项逐步回归方程：

表2 鲜切南瓜富集GABA的浸渍液组分Box-Behnken试验设计和结果

对回归模型进行方差分析（表3），结果表明，回归模型的F=35.00，p＜0.000 1，模型显著，其决定系数R2=0.978 3，说明此模型相关性良好，模型具有实践指导意义。

表3 回归模型方差分析

根据回归法分析所得二次方程，在试验设定范围内，得到对响应值有显著交互作用影响的两因素的响应曲面图，见图7。

当VB6浓度为0.3 mmol/mL时，MSG和CaCl2对鲜切南瓜中GABA富集的交互作用影响见图7。MSG和CaCl2的一次项和二次项分别对鲜切南瓜GABA含量有极显著的影响（p＜0.01），两者的交互作用也影响显著（p=0.000 9）（表3）。在固定的MSG浓度下，GABA含量随CaCl2浓度的增加呈先快速增加随后下降的趋势。当CaCl2浓度为3.35 mmol/L时，GABA富集量最大。当MSG质量浓度为10.24 mg/mL，GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物，添加适量的MSG可以促进GABA合成，形成有效积累[10]。Ca2+是GAD的激活剂，通过与GAD碳末端的Ca2+/CaM调节区域结合而激活其活性[13]，促进GABA富集。低氧通气下，MSG与CaCl2的联合处理可显著促进GABA含量的提高[8]，研究结果与此报道结果一致。

图7 MSG和CaCl2的交互作用对鲜切南瓜GABA含量影响的响应曲面图

根据Box-Behnken试验结果，鲜切南瓜富集GABA的最佳培养液组分浓度分别为CaCl2浓度3.35 mmol/L、MSG质量浓度10.24 mg/mL和VB6浓度0.37 mmol/mL，在此条件下鲜切南瓜富集GABA的预测值为0.546 mg/g，验证试验得出实测值为0.569 mg/g，说明预测值和实际值之间存在较高的拟合度，所建立的模型是可靠的，可以用来描述组分浓度与响应值之间的关系。以最适浸渍液浓度培养的鲜切南瓜GABA含量是是原料中的10.62倍，说明优化后的浸渍液组分能显著提高鲜切南瓜中GABA含量。

3 结论

首先研究了鲜切南瓜富集GABA的工艺，正交试验结果表明，浸渍液pH、浸渍温度和浸渍时间对鲜切南瓜GABA富集有显著影响，三因素的影响顺序依次为浸渍温度＞浸渍时间＞浸渍液pH，最佳的浸渍工艺为浸渍时间4 h，浸渍温度40 ℃，浸渍液pH 5.8，此时鲜切南瓜中GABA的富集量为0.291 mg/g，是原料的5.43倍。接着研究了浸渍液组分对鲜切南瓜富集GABA的影响，响应面的Box-Behnken试验结果表明，鲜切南瓜富集GABA的最佳浸渍液组分浓度为CaCl23.35 mmol/L、MSG 10.24 mg/mL和VB6浓度0.37 mmol/mL，在此条件下鲜切南瓜中GABA含量为0.569 mg/g，是原料的10.62倍。方差分析可知，CaCl2、MSG、VB6对鲜切南瓜中GABA的富集均有显著影响，MSG和CaCl2的交互作用对鲜切南瓜中GABA富集有显著影响。