董佳萍,颜飞翔,牛广财, *,陈龙,李思萱,任洁萍
1. 黑龙江八一农垦大学食品学院(大庆 163319);2. 黑龙江省农产品加工工程技术研究中心(大庆 163319)
中国生物发酵产业协会发布的《酵素产品分类导则》标准中,将酵素定义为以动物、植物和食用菌等为原料,经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素产品[1]。以一种或多种蔬菜、水果、中草药等为原料,通过酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、食用真菌等益生菌发酵工艺制备的较多。郭伟峰等[2]利用新鲜桑葚进行试验,主要考察SOD酶活力,经试验得出优化后工艺条件为接种醋酸菌接种量10%、发酵温度30 ℃、发酵时间24 h,按照该条件发酵所得到的桑葚酵素饮料色泽鲜艳,酸甜适中,气味浓厚,液体清澈无沉淀,有桑葚独特的香味;彭宁等[3]主要采用猕猴桃为主要原料,添加少许红糖,利用酵母菌和乳酸菌(4∶1)进行接种发酵,优化的猕猴桃酵素生产工艺为发酵时间5 d、发酵温度30 ℃、菌种接种量4%,此时感官得分93分。刘维兵等[4]以葡萄与海棠果为主要原材料,得出最优酵素发酵工艺为葡萄与海棠果质量比5∶1、酵母菌接种量0.20%、初始pH 3.8、发酵温度25 ℃、发酵时间24 h,该酵素具有一定抑菌性和抗氧化活性。大量研究表明,酵素具有抗疲劳、抗衰老、抑菌消炎、提高机体免疫力、保护肝脏、降血脂、促进消化、抗氧化抗肿瘤、控制糖病、清除自由基、抗诱变突变等功能[5-8]。酵素制备工艺中的自然发酵法发酵周期较长,而且不好控制,人工接种发酵法是酵素发酵中经常采用的快速发酵方法。
北五味子药用价值较高,是滋补性中药,列入卫计委公布的可用于保健食品的物品名单;大麦营养成分丰富,发芽后不但保留其本身的各种营养成分,而且还形成非常丰富的酶系。试验以北五味子和大麦芽为原料,以酵母菌为发酵剂,制备北五味子麦芽酵素,并对其SOD酶活性、总多酚含量以及体外抗氧化活性进行测定,以期为北五味子麦芽酵素产品开发与生产提供理论依据。
北五味子、大麦芽(均为市售);RV171葡萄酒活性干酵母(安琪酵母股份有限公司);Pectinex Ultra Color果胶酶(诺维信(中国)生物技术有限公司);SOD酶活力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)(南京建成生物工程研究所);福林酚试剂(国药集团);无水碳酸钠、维生素C、邻苯三酚、过氧化氢、硫酸亚铁等(均为分析纯,天津大茂化学试剂厂)。
WS108手持式折光仪(河北润联科技开发有限公司);HR7633打浆机(飞利浦家庭电器(珠海)有限公司);电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);TD5Z低速平衡离心机(金坛市城西春兰试验仪器厂);DL-CJ-1N超净工作台(北京东联哈尔仪器厂);EX324电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司);DRP-9082电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司);UV-1100紫外可见分光光度计(上海凌析达仪器)。
1.3.1 工艺流程
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 酶解
北五味子破碎后,添加Pectinex Ultra Color果胶酶进行酶解,果胶酶添加量2.0 mL/kg,置于50 ℃水浴中酶解2 h,过滤后的滤汁可溶性固形物含量8%,备用。
1.3.2.2 麦芽的糖化
用磨粉机磨粉,过40目筛,浸入38~40 ℃温水(粉水比1∶3)中浸泡40 min,升温到52 ℃下浸泡30 min。随后将温度控制在63~65 ℃左右,保持60 min,调节温度78 ℃,维持20 min灭酶,用100目筛网过滤,冷却备用。
1.3.2.3 杀菌
采用超声波杀菌方式对其原料进行杀菌。将按一定比例配好的麦芽汁与北五味子酶解液,在100 W超声波下处理15 min后,冷却至室温后接种。
1.3.2.4 活化与接种发酵
按照酵母粉与蒸馏水质量比1∶10溶解高活性干酵母,放置在32 ℃恒温水浴锅中活化30 min,菌数3.2×106CFU/mL,备用。
在无菌室内,按试验设计比例,接入活化好的酵母菌液,在不同温度和时间等条件下进行发酵。在发酵过程中和结束后分别测定该酵素产品的总多酚含量、SOD酶活及其抗氧化活性的变化。
1.4.1 麦芽与北五味子比例的选择
在酵母菌接种量0.6%、发酵温度28 ℃、发酵时间3 d条件下,考察麦芽汁与北五味子酶解液不同比例(1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5和1∶6)对酵素液中SOD酶活性和总多酚含量的影响,确定最适的麦芽汁与北五味子酶解液配比。
1.4.2 发酵时间的确定
选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5,原料进行处理后,酵母菌接种量0.6%,在28 ℃下发酵,分别在1~5 d时测定其总多酚和SOD酶活力,确定酵母菌的最适发酵时间。
1.4.3 发酵温度的确定
选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5,原料进行处理后,酵母菌接种量0.6%,分别在22,25,28,31和34 ℃条件下进行发酵3 d,测定其总多酚和SOD酶活力,确定酵母菌最适发酵温度。
1.4.4 接种量的确定
选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5,原料进行处理后,发酵温度设为28 ℃,酵母菌接种量分别为0.2%,0.4%,0.6%,0.8%和1.0%,发酵3 d,测定其总多酚和SOD酶活力,确定酵母菌最适接种量。
在单因素试验的基础上,以总多酚含量和SOD酶活力作为评价指标,采用L9(33)正交表来进行正交试验,以确定其最佳的发酵工艺参数。因素水平见表1。
表1 因素水平表
1.6.1 总多酚含量测定
采用福林酚法进行测定[9]。称取1 mL标准液或样品稀释后,加入1 mL福林酚试剂及3 mL 20% Na2CO3,摇匀,于50 ℃恒温水浴锅中反应30 min,在765 nm波长下测定吸光度。重复3次,取平均值,根据标准曲线计算样品中总多酚的含量。总多酚标准曲线回归方程为:y=0.179 2x+0.088 7,R2=0.998 6。
1.6.2 SOD酶活力的测定
将酵素液以3 800 r/min离心10 min后,按照SOD酶试剂盒说明书具体标准,进行酶活力的测定。
1.6.3 ABTS自由基清除能力的测定
按照试剂盒中说明书所标注的方法进行试验测定,根据已知的标准曲线y=-1.121 4x+1.126 2(R2=0.995 7)计算出清除能力,其中,y代表其抗氧化能力,x代表吸光度。
1.6.4 羟自由基清除能力的测定
取0.1 mL样品,加入2 mL 6 mmoL/L的过氧化氢溶液以及FeSO4溶液,摇匀静置10 min后,加入2 mL 6 mmoL/L的水杨酸溶液,摇匀,放置37 ℃恒温水浴中1 h,在波长510 nm下测定吸光度A1。以去离子水为参比溶液,测定吸光度A0,以同体积的蒸馏水代替水杨酸溶液,测定吸光度A2。按式(1)计算羟自由基清除能力[10]。
式中:A0为空白吸光度;A1为样液吸光度;A2为样液在体系中吸光度。
1.6.5 DPPH自由基清除能力的测定
将样品溶液稀释后,在试管中加入2 mL DPPH乙醇溶液及2 mL稀释后溶液。混合均匀后在25 ℃条件下,避光放置30 min,于517 nm波长下用无水乙醇调零,测定其吸光度A1。空白对照以无水乙醇代替样液,测定吸光度A0,以等体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液,测定吸光度A2[11]。按式(2)计算。
式中:A0为空白对照液吸光度;A1为样品测定管吸光度;A2为样品本底管吸光度。
由图1可以看出,SOD酶活力随着麦芽汁与北五味子酶解液比例增加至1∶5时,SOD酶活力最高可达3 117.13 U/mL,随着北五味子含量提高,SOD酶活力开始下降至最低为2 006.42 U/mL;从总多酚含量来看,同样在麦芽汁与北五味子酶解液1∶5时,其含量达到最高134.85 mg/mL。综合SOD酶活力与总多酚这2个指标,选择最适原料配比为麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5。
图1 不同麦芽汁与北五味子酶解液比例对酵素中SOD酶活力和总多酚含量的影响
由图2可知,随着发酵时间延长,发酵液中总多酚含量逐渐增加,发酵第3天,总多酚含量达到最高,为130.77 mg/mL。发酵初始阶段,SOD酶活力呈上升趋势,第2天达到最高值为3 117.13 U/mL,随后呈下降趋势。可能是因为酵母菌的数量随发酵时间延长而逐渐增加,致使发酵液中氧气含量减少,从而导致酵母菌无氧发酵产乙醇速率增加[12]。发酵第5天时,SOD酶活力和总多酚含量都降低。综合来看,确定酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最适发酵时间为3 d,此时,总多酚含量为130.77 mg/mL,SOD酶活力为3 108.52 U/mL。
图2 发酵时间对SOD酶活力和总多酚含量的影响
由图3可知,发酵温度逐渐升高时,发酵液中SOD酶活力也呈上升趋势,发酵温度28 ℃时SOD酶活力达到最高,可达3 270.37 U/mL。发酵温度继续升高时,SOD酶活力开始下降,到34 ℃时SOD酶活力最低。发酵温度升高至28 ℃时,总多酚含量增加至最高值,为138.19 mg/mL。发酵温度继续升高时,总多酚含量开始减少。综合2个指标,确定酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最佳发酵温度为28 ℃,此时总多酚含量为138.19 mg/mL,SOD酶活力为3 270.37 U/mL。
图3 发酵温度对SOD酶活力和总多酚含量的影响
由图4可知,酵母菌接种量由0.2%升高到0.8%时,总多酚含量逐渐增加并达到最大值,为140.03 mg/mL。随着接种量增加,SOD酶活力呈缓慢上升趋势;接种量0.8%时,SOD酶活力达到最高,为3 549.79 U/mL。接种量大于0.8%时,SOD酶活力和总多酚含量开始下降。因此,北五味子大麦芽酵素最适酵母菌接种量为0.8%,此时SOD酶活力为3 549.79 U/mL,总多酚含量为140.03 mg/mL。
由表2可知,酵母菌发酵对北五味子大麦芽酵素SOD酶活力影响的主次顺序为A>C>B,发酵温度对SOD酶活力的影响最大,其次为接种量,发酵时间对SOD酶活力的影响最小;由K值可知,以SOD酶活力为指标时的最优组合为A2B2C3,即发酵温度28 ℃,接种量0.8%,发酵时间3 d。对北五味子大麦芽酵素总多酚含量影响的主次顺序为A>C>B,发酵温度对总多酚含量影响最大,其次为发酵时间,接种量对总多酚含量的影响最小;由K’值可知,以总多酚为指标的最优组合为A2B2C3,即发酵温度28 ℃,接种量0.8%,发酵时间3 d。因此,酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最佳工艺条件为:发酵温度28 ℃,接种量0.8%,发酵时间为3 d。在此条件下,酵素产品的SOD酶活力为3 549.79 U/mL,总多酚含量为140.03 mg/mL。
图4 接种量对SOD酶活力和总多酚含量的影响
表2 正交试验结果
由表3可以看出,发酵前后DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除能力均略有下降,但是,羟自由基清除率有较明显上升,由原来的90.59%上升到98.09%,高于4 mg/mL维生素C对羟自由基清除率,说明该酵素对羟自由基有较好的清除效果。这可能是由于酵母菌的代谢产物增加导致多酚升高的缘故。黄雨洋等[13]研究结果表明,乙醇添加量在适合范围内,传质阻力小,多酚溶解性好,会使多酚得率和对羟自由基清除率增加。
表3 发酵前后清除自由基能力的变化
酵母菌发酵制备北五味子麦芽酵素的最优工艺条件为:大麦芽汁与北五味子酶解液配比1∶5、发酵温度28 ℃、接种量0.8%、发酵时间3 d。在该条件下,SOD酶活力达到3 549.79 U/mL,总多酚含量达到140.03 mg/mL。该酵素的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ABTS+自由基清除率较高,说明通过酵母菌发酵,可以制备总多酚含量与SOD酶活力较高且具有较好抗氧化活性的北五味子大麦芽酵素产品。