北五味子麦芽酵素发酵工艺优化及其生物活性初探

董佳萍，颜飞翔，牛广财, *，陈龙，李思萱，任洁萍

1. 黑龙江八一农垦大学食品学院（大庆 163319）；2. 黑龙江省农产品加工工程技术研究中心（大庆 163319）

中国生物发酵产业协会发布的《酵素产品分类导则》标准中，将酵素定义为以动物、植物和食用菌等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素产品[1]。以一种或多种蔬菜、水果、中草药等为原料，通过酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、食用真菌等益生菌发酵工艺制备的较多。郭伟峰等[2]利用新鲜桑葚进行试验，主要考察SOD酶活力，经试验得出优化后工艺条件为接种醋酸菌接种量10%、发酵温度30 ℃、发酵时间24 h，按照该条件发酵所得到的桑葚酵素饮料色泽鲜艳，酸甜适中，气味浓厚，液体清澈无沉淀，有桑葚独特的香味；彭宁等[3]主要采用猕猴桃为主要原料，添加少许红糖，利用酵母菌和乳酸菌（4∶1）进行接种发酵，优化的猕猴桃酵素生产工艺为发酵时间5 d、发酵温度30 ℃、菌种接种量4%，此时感官得分93分。刘维兵等[4]以葡萄与海棠果为主要原材料，得出最优酵素发酵工艺为葡萄与海棠果质量比5∶1、酵母菌接种量0.20%、初始pH 3.8、发酵温度25 ℃、发酵时间24 h，该酵素具有一定抑菌性和抗氧化活性。大量研究表明，酵素具有抗疲劳、抗衰老、抑菌消炎、提高机体免疫力、保护肝脏、降血脂、促进消化、抗氧化抗肿瘤、控制糖病、清除自由基、抗诱变突变等功能[5-8]。酵素制备工艺中的自然发酵法发酵周期较长，而且不好控制，人工接种发酵法是酵素发酵中经常采用的快速发酵方法。

北五味子药用价值较高，是滋补性中药，列入卫计委公布的可用于保健食品的物品名单；大麦营养成分丰富，发芽后不但保留其本身的各种营养成分，而且还形成非常丰富的酶系。试验以北五味子和大麦芽为原料，以酵母菌为发酵剂，制备北五味子麦芽酵素，并对其SOD酶活性、总多酚含量以及体外抗氧化活性进行测定，以期为北五味子麦芽酵素产品开发与生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北五味子、大麦芽（均为市售）；RV171葡萄酒活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；Pectinex Ultra Color果胶酶（诺维信（中国）生物技术有限公司）；SOD酶活力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）（南京建成生物工程研究所）；福林酚试剂（国药集团）；无水碳酸钠、维生素C、邻苯三酚、过氧化氢、硫酸亚铁等（均为分析纯，天津大茂化学试剂厂）。

1.2 仪器与设备

WS108手持式折光仪（河北润联科技开发有限公司）；HR7633打浆机（飞利浦家庭电器（珠海）有限公司）；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；TD5Z低速平衡离心机（金坛市城西春兰试验仪器厂）；DL-CJ-1N超净工作台（北京东联哈尔仪器厂）；EX324电子分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；DRP-9082电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；UV-1100紫外可见分光光度计（上海凌析达仪器）。

1.3 工艺流程与操作要点

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 酶解

北五味子破碎后，添加Pectinex Ultra Color果胶酶进行酶解，果胶酶添加量2.0 mL/kg，置于50 ℃水浴中酶解2 h，过滤后的滤汁可溶性固形物含量8%，备用。

1.3.2.2 麦芽的糖化

用磨粉机磨粉，过40目筛，浸入38～40 ℃温水（粉水比1∶3）中浸泡40 min，升温到52 ℃下浸泡30 min。随后将温度控制在63～65 ℃左右，保持60 min，调节温度78 ℃，维持20 min灭酶，用100目筛网过滤，冷却备用。

1.3.2.3 杀菌

采用超声波杀菌方式对其原料进行杀菌。将按一定比例配好的麦芽汁与北五味子酶解液，在100 W超声波下处理15 min后，冷却至室温后接种。

1.3.2.4 活化与接种发酵

按照酵母粉与蒸馏水质量比1∶10溶解高活性干酵母，放置在32 ℃恒温水浴锅中活化30 min，菌数3.2×106CFU/mL，备用。

在无菌室内，按试验设计比例，接入活化好的酵母菌液，在不同温度和时间等条件下进行发酵。在发酵过程中和结束后分别测定该酵素产品的总多酚含量、SOD酶活及其抗氧化活性的变化。

1.4 单因素试验

1.4.1 麦芽与北五味子比例的选择

在酵母菌接种量0.6%、发酵温度28 ℃、发酵时间3 d条件下，考察麦芽汁与北五味子酶解液不同比例（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5和1∶6）对酵素液中SOD酶活性和总多酚含量的影响，确定最适的麦芽汁与北五味子酶解液配比。

1.4.2 发酵时间的确定

选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5，原料进行处理后，酵母菌接种量0.6%，在28 ℃下发酵，分别在1～5 d时测定其总多酚和SOD酶活力，确定酵母菌的最适发酵时间。

1.4.3 发酵温度的确定

选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5，原料进行处理后，酵母菌接种量0.6%，分别在22，25，28，31和34 ℃条件下进行发酵3 d，测定其总多酚和SOD酶活力，确定酵母菌最适发酵温度。

1.4.4 接种量的确定

选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5，原料进行处理后，发酵温度设为28 ℃，酵母菌接种量分别为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%，发酵3 d，测定其总多酚和SOD酶活力，确定酵母菌最适接种量。

1.5 正交试验

在单因素试验的基础上，以总多酚含量和SOD酶活力作为评价指标，采用L9(33)正交表来进行正交试验，以确定其最佳的发酵工艺参数。因素水平见表1。

表1 因素水平表

1.6 指标测定

1.6.1 总多酚含量测定

采用福林酚法进行测定[9]。称取1 mL标准液或样品稀释后，加入1 mL福林酚试剂及3 mL 20% Na2CO3，摇匀，于50 ℃恒温水浴锅中反应30 min，在765 nm波长下测定吸光度。重复3次，取平均值，根据标准曲线计算样品中总多酚的含量。总多酚标准曲线回归方程为：y=0.179 2x+0.088 7，R2=0.998 6。

1.6.2 SOD酶活力的测定

将酵素液以3 800 r/min离心10 min后，按照SOD酶试剂盒说明书具体标准，进行酶活力的测定。

1.6.3 ABTS自由基清除能力的测定

按照试剂盒中说明书所标注的方法进行试验测定，根据已知的标准曲线y=-1.121 4x+1.126 2（R2=0.995 7）计算出清除能力，其中，y代表其抗氧化能力，x代表吸光度。

1.6.4 羟自由基清除能力的测定

取0.1 mL样品，加入2 mL 6 mmoL/L的过氧化氢溶液以及FeSO4溶液，摇匀静置10 min后，加入2 mL 6 mmoL/L的水杨酸溶液，摇匀，放置37 ℃恒温水浴中1 h，在波长510 nm下测定吸光度A1。以去离子水为参比溶液，测定吸光度A0，以同体积的蒸馏水代替水杨酸溶液，测定吸光度A2。按式（1）计算羟自由基清除能力[10]。

式中：A0为空白吸光度；A1为样液吸光度；A2为样液在体系中吸光度。

1.6.5 DPPH自由基清除能力的测定

将样品溶液稀释后，在试管中加入2 mL DPPH乙醇溶液及2 mL稀释后溶液。混合均匀后在25 ℃条件下，避光放置30 min，于517 nm波长下用无水乙醇调零，测定其吸光度A1。空白对照以无水乙醇代替样液，测定吸光度A0，以等体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，测定吸光度A2[11]。按式（2）计算。

式中：A0为空白对照液吸光度；A1为样品测定管吸光度；A2为样品本底管吸光度。

2 结果与分析

2.1 麦芽汁与北五味子酶解液比例的确定

由图1可以看出，SOD酶活力随着麦芽汁与北五味子酶解液比例增加至1∶5时，SOD酶活力最高可达3 117.13 U/mL，随着北五味子含量提高，SOD酶活力开始下降至最低为2 006.42 U/mL；从总多酚含量来看，同样在麦芽汁与北五味子酶解液1∶5时，其含量达到最高134.85 mg/mL。综合SOD酶活力与总多酚这2个指标，选择最适原料配比为麦芽汁与北五味子酶解液比例1∶5。

图1 不同麦芽汁与北五味子酶解液比例对酵素中SOD酶活力和总多酚含量的影响

2.2 发酵时间对北五味子麦芽酵素的影响

由图2可知，随着发酵时间延长，发酵液中总多酚含量逐渐增加，发酵第3天，总多酚含量达到最高，为130.77 mg/mL。发酵初始阶段，SOD酶活力呈上升趋势，第2天达到最高值为3 117.13 U/mL，随后呈下降趋势。可能是因为酵母菌的数量随发酵时间延长而逐渐增加，致使发酵液中氧气含量减少，从而导致酵母菌无氧发酵产乙醇速率增加[12]。发酵第5天时，SOD酶活力和总多酚含量都降低。综合来看，确定酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最适发酵时间为3 d，此时，总多酚含量为130.77 mg/mL，SOD酶活力为3 108.52 U/mL。

图2 发酵时间对SOD酶活力和总多酚含量的影响

2.3 发酵温度对北五味子麦芽酵素的影响

由图3可知，发酵温度逐渐升高时，发酵液中SOD酶活力也呈上升趋势，发酵温度28 ℃时SOD酶活力达到最高，可达3 270.37 U/mL。发酵温度继续升高时，SOD酶活力开始下降，到34 ℃时SOD酶活力最低。发酵温度升高至28 ℃时，总多酚含量增加至最高值，为138.19 mg/mL。发酵温度继续升高时，总多酚含量开始减少。综合2个指标，确定酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最佳发酵温度为28 ℃，此时总多酚含量为138.19 mg/mL，SOD酶活力为3 270.37 U/mL。

图3 发酵温度对SOD酶活力和总多酚含量的影响

2.4 接种量对北五味子麦芽酵素的影响

由图4可知，酵母菌接种量由0.2%升高到0.8%时，总多酚含量逐渐增加并达到最大值，为140.03 mg/mL。随着接种量增加，SOD酶活力呈缓慢上升趋势；接种量0.8%时，SOD酶活力达到最高，为3 549.79 U/mL。接种量大于0.8%时，SOD酶活力和总多酚含量开始下降。因此，北五味子大麦芽酵素最适酵母菌接种量为0.8%，此时SOD酶活力为3 549.79 U/mL，总多酚含量为140.03 mg/mL。

2.5 北五味子大麦芽酵素的工艺条件优化

由表2可知，酵母菌发酵对北五味子大麦芽酵素SOD酶活力影响的主次顺序为A＞C＞B，发酵温度对SOD酶活力的影响最大，其次为接种量，发酵时间对SOD酶活力的影响最小；由K值可知，以SOD酶活力为指标时的最优组合为A2B2C3，即发酵温度28 ℃，接种量0.8%，发酵时间3 d。对北五味子大麦芽酵素总多酚含量影响的主次顺序为A＞C＞B，发酵温度对总多酚含量影响最大，其次为发酵时间，接种量对总多酚含量的影响最小；由K’值可知，以总多酚为指标的最优组合为A2B2C3，即发酵温度28 ℃，接种量0.8%，发酵时间3 d。因此，酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最佳工艺条件为：发酵温度28 ℃，接种量0.8%，发酵时间为3 d。在此条件下，酵素产品的SOD酶活力为3 549.79 U/mL，总多酚含量为140.03 mg/mL。

图4 接种量对SOD酶活力和总多酚含量的影响

表2 正交试验结果

2.6 北五味子麦芽酵素抗氧化活性的测定

由表3可以看出，发酵前后DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除能力均略有下降，但是，羟自由基清除率有较明显上升，由原来的90.59%上升到98.09%，高于4 mg/mL维生素C对羟自由基清除率，说明该酵素对羟自由基有较好的清除效果。这可能是由于酵母菌的代谢产物增加导致多酚升高的缘故。黄雨洋等[13]研究结果表明，乙醇添加量在适合范围内，传质阻力小，多酚溶解性好，会使多酚得率和对羟自由基清除率增加。

表3 发酵前后清除自由基能力的变化

3 结论

酵母菌发酵制备北五味子麦芽酵素的最优工艺条件为：大麦芽汁与北五味子酶解液配比1∶5、发酵温度28 ℃、接种量0.8%、发酵时间3 d。在该条件下，SOD酶活力达到3 549.79 U/mL，总多酚含量达到140.03 mg/mL。该酵素的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ABTS+自由基清除率较高，说明通过酵母菌发酵，可以制备总多酚含量与SOD酶活力较高且具有较好抗氧化活性的北五味子大麦芽酵素产品。