高效液相色谱法测定注射用左亚叶酸钠的有关物质

朱丽娟

摘   要：为了研究注射用左亚叶酸钠中的相关物质，文章使用色谱检验法，检测出左亚叶酸钠的定量限为2.0 ng，检测限为0.6 ng。可见，高效液相色谱法可用于测定注射用左亚叶酸钠的有关物质。

关键词：左亚叶酸钠;高效液相色谱法;有关物质

色谱检测法指的是将不同的细菌混合物在特定的环境中进行相互溶解、解析、吸附、脱附，在以上的环境中进行多次的操作之后能够得到物质的分离现象，并且随之使用不同的检测形式进行细菌内部的检验，能够将细菌甄别到属、种甚至株，能够保证较高的分辨率和较为准确的检验结果，并且分析的速度较快，能够在检验的过程中分析出较为稳定的指标。在分析中不会受到细菌年龄、生长条件等客观因素的影响，对于细菌的鉴别具有十分重要的作用。

1    实验方法

材料准备需要注射用左亚叶酸钠放置于饱和湿度敷箱培养，培养温度为37 ℃。

1.1  专属性实验

（1）96孔板接种细胞：PC-3和RWPE-1，HCT-116接种质量浓度为5 000个/孔、2 000个/孔。每9个实验组为96孔板，每一个孔板上有6个复孔。其中，培养要求是0.25%胰酶-EDTA能够在常规环境中完全消化，并且成为单个细胞悬液。培养的要求为在CO2的饱和湿度敷箱培养，培养温度为37 ℃，培养时间为24 h。

刺激细胞：对于左亚叶酸钠干预细胞的刺激强度为0～8.4 mmol/L依次递增的情况，进而能够看出不同刺激强度的背景下，干预细胞自身出现的情况和变化，保证实验效果的科学性和真实性。培养的要求为在CO2的饱和湿度敷箱培养，培养温度为37 ℃，培养时间为72 h。

（3）呈色：在上述步骤进行之后，在培养容器中添加5 mg/mL的MTT溶液20 μL（每孔剂量），并且保证培养环境的稳定和正常，此次的培养时间为3 h左右。在此基础上，将上清液吸走，并且在培养孔中添加150 μL DMSO。值得注意的是，添加此类试剂之后，液体中极易出现沉淀物，需要将试管轻轻晃动，保证添加剂能够充分溶解。

1.2  溶液稳定性试验—SDS-PAGE凝胶电泳

灌分离胶：TEMED加入的计量与分子量的不同配置不同浓度之间具有密切的关系。在灌胶的过程中应当保证灌胶的速度，在灌胶高度在容器总高度的1/3左右，即5.5 cm左右的情況下就代表灌胶结束。此时，可以使用双蒸水缓慢封闭容器。由于这一系列的操作关系着实验的稳定性和准确性，在进行操作的过程中应当采用轻柔缓慢的操作手法，避免对人工环节造成影响。在整体的操作结束之后，将实验设备静置30 min左右，随后观察情况。

灌浓缩胶：30 min自由凝固结束之后，观察到容器中水和胶水之间中存在一条明显的折线就能够证明胶水已经凝固。当胶水凝固之后则可以进行下一步实验工作，添加一部分水在容器上方，多余的水分需要使用纸巾擦拭干净。与此同时，将配置好的试剂快速加入其中，在添加之后保证设备能够平稳静置，保证静置时间在30 min以上。24 h之后，将膜取出用磷酸化或非磷酸化漂洗3次，每次10 min。磷酸化二抗稀释液：3%的牛奶稀释。非磷酸化二抗稀释液：3%的牛奶稀释。将膜放入加了二抗的二抗稀释液中，室温慢摇3 h。孵育完毕后用磷酸化或非磷酸化漂洗3次，每次10 min。

1.3  含量测定

1.3.1  细胞准备

对于PC-3细胞，0.25%胰酶-EDTA进行常规消化，PC-3和RWPE-1、HCT-116接种浓度为5 000个/孔、2 000个/孔。每9个实验组为96孔板，每一个孔板上有6个复孔。在相同的环境背景下，4.8 mmol/L，7.2 mmol/L的左亚叶酸钠对于p-mTOR的表达都具有明显的影响作用，并且应用在p-p70S6k，p-S6，p-4E和p-4E-BP1的表达的影响上效果相同。

1.3.2  蛋白样品的制备

（1）保证培养时间超过24 h，对细胞进行冲洗，冲洗使用的试剂是4 ℃预冷的PBS。每瓶细胞将PBS尽量吸取干净，而后加入200 μL含蛋白酶抑制剂的RIPA，冰上裂解20 min。

（2）在上述工作完成之后，使用等移液枪缓慢将细胞碎片吹打至瓶底一角（称为裂解蛋白液），在裂解蛋白液的过程中应当保证不要有气泡。将裂解之后的试剂放在冰上静置10 min左右，与此同时将离心机进行4 ℃预冷。

（3）将裂解蛋白液移至EP管内，12 000 r，30 min，同时打开紫外分光光度仪进行初始化。

（4）取3×10 μL共3管，用不含蛋白酶抑制剂的RIPA洗3次，在上述步骤进行之后，在培养容器中添加5 mg/mL的MTT溶液20 μL（每孔剂量），并且保证培养环境的稳定和正常，此次的培养时间为3 h左右。在此基础上，将上清液吸走，并且在培养孔中添加150 μL DMSO。需要将培养皿放在摇床上轻轻摇动，保证其中的试剂能够充分溶解。

2    实验结果

色谱检验在实行的过程中具有极强的敏感性和特异性，在进行病原体和微生物检验检测的过程中，能够呈现出自身的优势，对于微生物的检验过程中对于微生物样本的质量要求较低，即便是检测样本中存在大量死亡微生物，也能够保证检验的有效性和准确性。一旦检测样本中有两种或者是两种以上的微生物，传统意义上的检验进程需要进行微生物的提纯，进而保证检验的真实性，而色谱检验则可以在样本成分复杂的情况下进行检验，并且提供准确的检验效果。本品分别在酸、碱、氧化、光照、高湿及高温条件中进行强制破坏，各降解产物均能检出，且与主成分峰能达到良好分离。

3    结语

左亚叶酸钠在世界范围内的临床诊疗中具有广泛并且良好的使用效果，由于在治疗的过程中副作用较小，成为医生们高频使用的药物。近年来，左亚叶酸钠逐渐被发现在治疗肿瘤的治疗中具有良好的效果，但是其中存在的安全隐患和局限性仍旧未能得到良好的整合和研究。在诊疗过程中使用抗雄激素疗法能够取得相应的治疗成效，然而患者在接受诊疗的过程中经常出现对激素治疗的抵抗现象，进而影响了前列腺治疗的稳定性和有效性。长时间内对于治疗前列腺的方式方法均没有稳定的界定和实施，逐渐成为前列腺疾病治疗的关键性难题。

[参考文献]

[1]杨成.高效液相色谱法测定注射用左亚叶酸钠的有关物质[J].临床医药文献电子杂志，2019（21）：185-186，188.

[2]周平凡，王东凯.pH对左亚叶酸钠注射液稳定性的影响[J].中国新药杂志，2017（24）：2995-2998.