QuEChERS净化结合UHPLC-MS/MS同时测定饲料中β-受体激动剂类和喹噁啉类药物

刘新辉 纪祥龙 孙艳丽* 王情情 周秀芝 李芳华 刘 梅 张 帅

(1.山东拜尔检测股份有限公司，山东潍坊261000；2.山东省绿色食品发展中心，山东济南250000）

β-受体激动剂在生物体内具有“再分配效应”， 使用β-受体激动剂可以显著增加动物骨骼肌的重量，同时减少脂肪的重量，但对整体的体重没有显著的影响，提高了饲料转化率和胴体的瘦肉率，并可减少蛋白的分解，常见于畜禽养殖中的违法添加。但因添加剂量远大于人类的治疗剂量，家畜摄入后，较高的残留量在体内长时间残留，人类食用后可能会产生行走不稳、肌肉震颤、心律失常、恶心、晕眩等中毒症状，对高血压、冠心病、甲状腺功能亢进者影响尤为严重[1]。

喹噁啉类药物是具有喹噁啉-N1，N4-二氧化物基本结构的一类化学合成的动物专用药，具有广谱抗菌、提高饲料转化率和增加畜禽瘦肉率的作用。药物中的N→O 基团具有致癌、致畸、致突变性，在体内脱氧代谢过程中伴随氢氧自由基的产生，对细胞组织有很强的破坏作用，引起DNA损伤和毒害[2]。

在饲料β-受体激动剂和喹噁啉类的检测过程中，样品中的脂类物质、蛋白质、金属离子会干扰待测物检测，基质增强效应或抑制效应会导致化合物的测试回收率与实际回收率相差很大，影响回收率的计算，导致测试数据与实际结果存在较大偏差。现行标准NY/T 3145—2017《饲料中22种β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法》、农业部2086 号公告-5-2014《饲料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的测定 液相色谱-串联质谱法》中均采用固相萃取净化。经验证：外加标样品及阳性样品与标准品的丰度比超出标准要求范围，通过调整色谱分离条件依旧不满足要求，表明净化结果不理想，难以准确定性。

本研究采用Cleanert LipoNo 和Cleanert PSA进行净化，较固相萃取净化基质去除率更高且丰度比满足标准要求，并实现了饲料中20 种β-受体激动剂类和3 种喹噁啉类药物的同时检测，可在一定程度上解决复杂样品基质分析难的问题，并对饲料中2类药物的检测提供了新的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Cleanert LipoNo、Cleanert PSA（平均粒径：40～60 μm；平均孔径：60 Å；比表面：480 m2/g），购自天津博纳艾杰尔公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸铵均为色谱纯，购自德国CNW公司；无水硫酸钠、氯化钠为分析纯，购自中国国药集团化学试剂有限公司；沙丁胺醇、莱克多巴胺盐酸盐、硫酸特布他林、马布特罗盐酸盐，购自BePure公司；盐酸克伦特罗、盐酸班布特罗、克仑普罗、马喷特罗盐酸盐、喹乙醇、卡巴氧，购自Dr.Ehrensorfer公司；齐帕特罗、西马特罗、西布特罗、妥布特罗盐酸盐，购自WITEGA公司；氯丙那林、溴布特罗、喷布特罗盐酸盐、福莫特罗酒石酸盐、克伦特罗内标-D9、盐酸莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3，购自曼哈格公司；利托君，购自TRC公司；喹烯酮，购自中国计量科学研究院。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290Ⅱ-6460QQQ(配有电喷雾离子源(ESI)及Masshunter Quantitative B.08.00 数据处理系统)，购自美国Agilent 公司；ME 240E 分析天平，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；AS-E40UVT-R纯水仪，购自重庆奥思德仪器设备有限公司；DG-2500R 多管漩涡混合仪，购自上海巴玖实业有限公司；N-EVAP112 氮吹仪，购自Organomation Associates Inc 公司；3K15 冷冻离心机，购自德国sigma 实验室离心机股份有限公司；Dispensette®Organic分液器，购自德国BRAND公司。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 单一标准溶液的配制

分别称取20 种兽药标准物质及3 种内标标准物质各10 mg（精确到0.01 mg）用甲醇溶解，定容至10 ml 容量瓶中，配制成1.0 mg/ml 的单一标准储备液，-20 ℃下保存待用。

1.3.2 混合标准溶液的配制

从1.3.1 单一标准储备液中各吸取0.5 ml 溶液于50 ml 容量瓶中，以甲醇将其稀释定容为10 μg/ml 的混合标准中间液，吸取混合标准中间液0.5 ml 于50 ml容量瓶中，以甲醇将其稀释定容为100 ng/ml的混合标准工作液，于4 ℃下避光保存；按同样方式将3 种内标物稀释为100 ng/ml 的混合内标工作液，于4 ℃下避光保存。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent InfinityLabPoroshell 120 EC-C18色谱柱（3.0 mm×10 mm，1.8-Micron，薄壳型反相C18填料）；流动相：A 为5 mmol/l 乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），B 为甲醇（含0.1%甲酸）；流速0.45 ml/min；柱温35 ℃；进样量2 μl；采样梯度洗脱程序：0～1 min，

10% B；1～2 min，10% B～60% B；2～3 min，60% B；3～3.5 min，60% B～90% B；3.5～5 min，90% B；5～5.5 min，90% B～10% B；5.5～7 min，10% B。

1.4.2 质谱条件

仪器系统配备三重四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI），正离子模式下多反应监测（MRM）采集方式。干燥气温度为325 ℃，干燥气流速为9 L/min，鞘气温度为350 ℃，鞘气流速为10 L/min，雾化器压力为35 psi，具体的质谱条件如表1所示。

1.4.3 样品前处理

制样：抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。粉碎后过0.45 mm孔径的分析筛[3]，混匀，装入磨口瓶中备用。

提取：准确称取2.0 g样品（精确至0.01 g）于50 ml具塞聚丙烯离心管中，加入内标工作溶液100 μl，静置10 min。加入5 ml 1%乙酸水溶液，涡旋混匀2 min后静置10 min[4]。加入20 ml 1%乙酸乙腈，于涡旋振荡器上剧烈振荡10 min、40 ℃超声提取10 min、再剧烈振荡5 min，加入2 g 氯化钠[5-6]，涡旋混匀2 min，在8 000 r/min条件下离心5 min。

表1 20种兽药及3种内标的质谱检测条件

净化：移取10 ml 上清液于Cleanert LipoNo 净化管中（净化管中事先称入2 g无水硫酸钠、0.5 g Cleanert PSA[7]），涡旋混匀2 min，静置分层。移取5 ml 上清液在40 ℃下氮气吹干，加入1 ml 复溶液（甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8）涡旋溶解，过0.22 μm滤膜后待测定。

2 结果与分析

2.1 样品净化方式的优化

Cleanert LipoNo为大颗粒填料，净化后静置1 min即可，无需离心，操作简单。与传统QuEChERS方法比较，简化了操作步骤。在购置的Cleanert LipoNo 净化管中称入0.5 g Cleanert PSA，PSA有两个氨基，pKa值分别为10.1和10.9，可与金属离子产生螯合作用，用于提取金属离子，有效降低了金属离子导致的基质效应。本研究与固相萃取净化相比，无需特殊装置、成本低、操作简便、耗时短，符合当前高通量的发展趋势。

2.2 样品预处理条件的优化

本试验考察了乙腈、1%乙酸乙腈、1%乙酸水-1%乙酸乙腈3 种提取溶剂对提取效果的影响。结果显示：1%乙酸水-1%乙酸乙腈做提取溶剂时，回收率最高且精密度最好，乙腈做提取溶剂时回收率最差。分析原因是因为乙酸水的水解作用及样品经过预先浸润后目标物与提取溶剂的接触面积增大[8]，故获得了最高的提取效率。

部分饲料中蛋白质含量较高，如不有效去除将影响目标物离子化并损伤色谱柱。沉淀蛋白质的溶剂主要有酸、沉淀剂和有机溶剂。本研究考虑到目标物的溶解性、提取溶剂的浸润性和与基质固相分散萃取的兼容性，采用了有机溶剂沉淀法[9]，经考察比较发现1%乙酸乙腈比1%乙酸甲醇效果好。

2.3 除脂填料的确定

饲料中脂类的去除程度将决定最终上机溶液的澄清度及基质效应的强弱，比较了Cleanert LipoNo、Cleanert ODS C18、Captiva EMR-Lipid、乙腈饱和正己烷4种净化方式。其中Cleanert LipoNo填料表面修饰了许多长的碳链，可针对性地吸附脂肪，对甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯均有高选择性的吸附效果[10]，其分子结构如图1所示，可有效降低油脂引起的基质效应。

C18 能有效吸附油脂，但需要经过离心，且最终复溶液澄清度差，阳性样品确证实验的相对标准偏差大于28.9%，难以满足法规要求；Captiva EMR-Lipid可高选择性、高效地去除脂质，而不会造成分析物损失。新型EMR-Lipid 技术结合了体积排阻和疏水相互作用[11-12]，在此基础上实现脂质去除，最大程度减少目标分析物的离子抑制，从而显著提高方法的可靠性和耐用性；因饲料样品种类多且基质复杂，利用乙腈饱和正己烷净化，极易发生乳化现象[13]，后续操作难以进行。本试验研究了以上4 种净化方式对饲料提取液净化效果的影响，4 种不同填料分别称取1 g，考察对甘油单油酸酯、辛酸甘油二酯、甘油三月桂酸酯的去除效率，结果如图2 所示，可以看出，Cleanert LipoNo 和Captiva EMR-Lipid 可获得较满意的除脂效果，综合考量成本和前处理的便捷性，确定Cleanert LipoNo为最佳的除脂填料。

图1 甘油单油酸酯、辛酸甘油二酯、甘油三月桂酸酯的分子结构

图2 Cleanert LipoNo、Cleanert ODS C18、Captiva EMR-Lipid、乙腈饱和正己烷对脂质的去除效率

2.4 基质去除材料的确定

比较了Cleanert LipoNo+PSA（质量比4/1）、C18+PSA（质量比1/1）、PRIME HLB、氧化锆、疏水体积排阻材料5 种基质去除方式。以基质最为复杂的配合饲料为试验材料，把5种基质去除材料的最终萃取物进行GC/MS 全扫描[14]，对全扫描色谱图进行积分，计算得出了5种填料对样品的基质去除率分别为85%、70%、83%、55%、74%。结果表明5 种材料中，Cleanert LipoNo+PSA 能够更有效地去除样品中的基质干扰。分析原因可能是因为Cleanert LipoNo+PSA 的组合高选择性的吸附了油脂、有机酸、色素、金属离子和酚类[15]。

2.5 色谱和质谱条件的优化

目标物经色谱分离时，流动相、进样介质、进样体系、色谱柱类型均会影响色谱峰型。饲料提取液经净化后依旧存在复杂的干扰物，本研究所用色谱柱中的薄壳型反相C18 填料使目标物仅在表面薄壳内进行吸附分配，通过降低扩散路径改善了被分析物的传质效率[16]，提高了柱效，峰型更尖锐、灵敏度更高；使用纯乙腈为进样介质时，会因溶剂效应造成峰分叉，最终确定甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8为最佳复溶液；使用甲醇-水作为流动相时，化合物色谱峰会拖尾、不对称、灵敏度低，加入乙酸铵改善了分离度，加入甲酸促进了目标物的离子化，因此选择5 mmol/l乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）-甲醇（含0.1%甲酸）为最佳流动相。

在液质联用中由于非挥发性组分与待测物质在雾滴表面离子化的过程中会产生竞争，这种竞争可能会增强或者抑制被分析物离子的形成效能，也就是说被分析物离子的形成效能与进入电喷雾离子源的基质密切相关[17]。本研究在质谱仪采集方法中设置分段扫描，将目标物出峰前强极性的污染物切入废液，避免其在离子源中的集聚，进一步降低了离子化过程中基质干扰导致的基质效应[18]。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性范围与定量限

完成前处理与仪器测定的优化后，按1.4.3 的方法制备空白基质溶液，并用此基质空白溶液对混合标准工作液逐级稀释成1、5、10、35、50 ng/ml 的系列标准溶液并依次进UHPLC-MS/MS 测定，X 轴设定为质量浓度作为横向坐标，Y轴设定为峰面积作为纵向坐标，由此完成标准曲线的绘制并进行线性回归。所得结果表明：20种兽药的浓度范围为1～50 ng/ml时，线性关系良好，相关系数R2取值范围为0.990 3～0.999 1，具备试验的可行性；同时，以S/N≥10确定β-受体激动剂类定量限为5 μg/kg、喹噁啉类定量限为50 μg/kg。

2.6.2 方法的准确度与精密度

分别选取配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料阴性样品基质，根据定量限水平进行加标，按照确定的提取、净化方法在选定的仪器条件下进行测定，每个浓度水平重复测定6 次，计算所得各种药物的平均回收率、相对标准偏差范围如表2 所示，可见方法的回收率高、重现性好。

表2 平均回收率、相对标准偏差范围

2.7 与国家标准方法比较

与NY/T 3145—2017《饲料中22种β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法》、农业部2086 号公告-5—2014《饲料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的测定 液相色谱-串联质谱法》标准相比，无需固相萃取净化，适用于大批量样品的操作，即可作为筛查手段又可准确定性定量；所用试剂种类少且用量少，廉价易得，环境友好；β-受体激动剂类的标准定量限为10 μg/kg，本方法定量限为5 μg/kg；喹噁啉类标准定量限为200 μg/kg 或400 μg/kg，本方法定量限为50 μg/kg，定量限的降低除得益于仪器灵敏度的提高外，也进一步说明了净化方法的除杂效果好，背景干扰低。

2.8 实际样品的检测

从市场上随机购买了40 份饲料（配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料各10 份）进行检测，其中2 份饲料喹烯酮含量分别为4 670、1 880 μg/kg；1 份饲料克伦特罗含量为8.8 μg/kg。检测过程中按2倍定量限进行加标，作为试验过程中的质控，喹烯酮回收率为90.6%，克伦特罗回收率为96.8%。阳性样品的检出及较高的回收率，进一步证明了方法的可行性和准确性。

3 结论

通过优化样品预处理条件、基质去除材料、色谱和质谱条件，建立了饲料中β-受体激动剂和喹烯酮类物质的高效液相色谱-串联质谱检测方法。本方法前处理简单、精密度高，Cleanert LipoNo与PSA相结合可有效去除脂质与金属离子，较低的基质效应可有效降低检出限并提高了定性准确性，是各类饲料中β-受体激动剂和喹烯酮类物质含量水平检测分析的有效方法。无论对承检机构还是企业内部质控，本研究方法在试剂耗材的购入、预处理方法及仪器方法的优化设置上都较现行标准易于实行。更低的检出限将更易检出阳性样品，更好的净化效果将延长色谱柱寿命、减少对质谱仪的污染并保证定性结果的准确性。